【摘要】： Foxp3是FOX(forkhead box)家族轉錄因子中的一員,是調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)的特異性標志,同時對Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮等方面起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)表達外源性Foxp3可使非調節(jié)性T細胞具有類似調節(jié)性T細胞樣的表型及免疫抑制功能。Foxp3的突變可能導致調節(jié)性的CD4~+CD25~+T細胞介導的免疫耐受缺陷。 HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)基因編碼的反式激活蛋白(transactivator,TAT)中的蛋白轉導結構域(protein transductiondomain,PTD)能夠攜帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細胞膜而進入細胞漿和細胞核內,同時具有高效、快速的特點。 目的:構建帶HIV-1穿膜序列原核表達載體pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3,表達并純化小鼠PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白,研究融合蛋白導入細胞的效率及其對T細胞活化增殖的免疫調節(jié)功能的影響。 方法:利用基因重組技術構建pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3原核表達載體,并在大腸埃希菌Rosetta(DE3)中表達融合蛋白,經(jīng)Ni~(2+)分離柱純化融合蛋白。Western-blot技術檢測融合蛋白表達的正確性,流式細胞術檢測融合蛋白穿越細胞膜進入小鼠T淋巴細胞瘤株EL-4細胞中的能力,并通過混合淋巴細胞反應初步分析融合蛋白對T細胞活化增殖的影響。 結果:成功構建了pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白表達載體,表達并純化了PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白。通過流式細胞術分析證實表達的融合蛋白均能高效的轉入細胞內;同時經(jīng)混合淋巴細胞反應初步表明PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能明顯抑制T淋巴細胞的活化增殖能力,而PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3突變體融合蛋白抑制T細胞活化增殖的能力喪失。 結論:成功表達具有生物學活性的PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白,為進一步更好地研究Foxp3的免疫抑制功能和構建表達人PTD-Foxp3相關融合蛋白奠定了基礎。
[Abstract]:Foxp3 is a member of FOX (forkhead box) family transcription factors and a specific marker of regulatory T cell (regulatory T cells,Treg. It also plays a key role in the genesis, development, function maintenance and development of Treg. It has been found that the expression of exogenous Foxp3 can make non-regulatory T cells have a regulatory T-cell-like phenotype and immunosuppressive function. The mutation of Foxp3 may lead to regulatory CD4~ CD25~ T cell-mediated immune tolerance defects. HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) the protein transduction domain (protein transductiondomain,PTD) of the transactivator protein (transactivator,TAT) encoded by the gene can carry foreign proteins into almost all eukaryotic membranes and into the cytoplasm and nucleus. At the same time, it has the characteristics of high efficiency and fast. Objective: to construct a prokaryotic expression vector pET28a-PTD- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP-Foxp3, with HIV-1 transmembrane sequence and purify mouse PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3,PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein. To study the effect of fusion protein on T cell activation and proliferation. Methods: the prokaryotic expression vector of pET28a-PTD- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP-Foxp3 was constructed by gene recombination technique, and the fusion protein was expressed in Escherichia coli Rosetta (DE3). The fusion protein was purified by Ni~ (2) column. The expression of fusion protein was detected by Western-blot, and the ability of fusion protein to cross cell membrane into mouse T lymphocyte tumor EL-4 cell line was detected by flow cytometry. The effect of fusion protein on T cell activation and proliferation was analyzed by mixed lymphocyte reaction. Results: pET28a-PTD- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein expression vector was successfully constructed, and PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3,PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein was expressed and purified. Flow cytometry showed that the expressed fusion protein could be efficiently transferred into the cells. At the same time, the mixed lymphocyte reaction showed that PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein could significantly inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes, while the PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3 fusion protein could inhibit the activation and proliferation of T cells. Conclusion: the successful expression of PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3,PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein with biological activity lays a foundation for the further study of the immunosuppressive function of Foxp3 and the construction of human PTD-Foxp3 related fusion protein.
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R341

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳忠東,馬艷,曾憲端;妊娠滋養(yǎng)葉細胞疾病p21蛋白表達的研究[J];癌癥;1999年S1期

2 李治昊;高梅;葉珊;趙京卉;甘友清;;蛋白質轉導技術的應用及研究進展[J];西部醫(yī)學;2007年06期

3 胡晨;王越;陳彬;姜曉梅;李渝萍;婁桂予;張艷;何鳳田;周度金;;PNRC多肽通過干擾核受體途徑抑制BT474細胞的增殖[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2010年06期

4 陳彬;王越;胡晨;陽玉鵬;李渝萍;婁桂予;張艷;何鳳田;周度金;;PNRC多肽通過影響Ras信號途徑抑制BT-474細胞的增殖[J];中國癌癥雜志;2009年03期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關會議論文 前3條

1 張晨;陳曉超;劉樹滔;劉元剛;饒平凡;;融合蛋白PTD-SOD對紫外輻射下L-02細胞的保護和修復能力的研究[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

2 劉樹滔;張晨;趙花琴;陳曉超;饒平凡;;融合蛋白PTD-SOD對紫外輻射引起的細胞損傷的保護作用[A];中國食品科學技術學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

3 胡晨;王越;陳彬;姜曉梅;李渝萍;婁桂予;張艷;何鳳田;周度金;;PNRC多肽通過干擾核受體途徑抑制BT474細胞的增殖[A];重慶市生物化學與分子生物學學術會議論文摘要匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前3條

1 吳曼;中國檢測技術堪稱一流[N];中國國門時報;2002年

2 記者 董惠池;中美UL安全認證合作成果顯著[N];中國國門時報(中國出入境檢驗疫報);2000年

3 特約記者 左世云;中國石油技術開發(fā)公司出口土庫曼第一套鉆機成功投產(chǎn)[N];中國石油報;2002年

相關博士學位論文 前1條

1 張才;NPY對奶牛肝糖異生和脂肪動員關鍵酶表達的影響[D];吉林大學;2008年

相關碩士學位論文 前2條

1 張美芳;PTD-GFP、PTD-EDAG融合蛋白質的表達、純化和初步應用[D];天津大學;2008年

2 周小兵;PTD-ΔhNFATminiDBD蛋白在大鼠心臟移植急性排斥模型中的應用研究[D];江蘇大學;2010年

，

本文編號：2407739