【摘要】： 由于冷凍干燥法具有其它長期保存法無法比擬的一些優(yōu)點,該方法已成為細胞長期保存方法中新的研究熱點。所以凍干保存也有可能成為最有效的紅細胞長期保存方法。但影響凍干細胞回收率的因素非常多,包括凍干前紅細胞的處理、保護劑組成(成份和濃度)、添加洗滌方式、冷凍過程、干燥過程和復水等。維持紅細胞胞膜完整性和紅細胞的生理功能是紅細胞凍干成功的關鍵點和難點。本論文將圍繞紅細胞在凍干前負載海藻糖及其對紅細胞理化特性的影響、凍干保護液的選擇、凍干過程中對紅細胞的影響因素以及復水條件對紅細胞回收率的影響這一條主線展開討論,通過大量的實驗研究這些因素對人的紅細胞凍干效果的影響,并對人紅細胞凍干和復水方法進行優(yōu)化。 一、凍干前人紅細胞對海藻糖的負載及其對紅細胞理化特性的影響 第一部分研究了紅細胞負載海藻糖的影響因素和有效方法,并通過評價負載海藻糖對紅細胞各項理化指標的影響,證明負載后紅細胞仍然能較好的執(zhí)行其生理功能。使用硫酸-蒽酮法測定胞內(nèi)海藻糖含量,同時對胞外游離血紅蛋白水平進行評價。檢測負載后紅細胞各項理化指標,通過流式細胞術檢測負載后紅細胞膜的完整性。結(jié)果顯示紅細胞對海藻糖的負載量和負載溫度、時間及負載緩沖液海藻糖濃度密切相關,隨溫度的升高、時間的延長和負載緩沖液海藻糖濃度的增加,紅細胞對海藻糖的攝取量也隨之增加。兩組紅細胞各項理化指標比較結(jié)果為兩組各項指標間無顯著差異((p＞0.05))。流式結(jié)果顯示紅細胞在高滲環(huán)境中負載海藻糖后,細胞膜結(jié)合很少量Annexin-V-FITC,并且破損紅細胞能被有效清除。 確定紅細胞負載海藻糖的最佳條件,即,在37℃條件下,采用新鮮紅細胞在海藻糖濃度為800mmol/L的負載緩沖液中孵育7h能有效攝取海藻糖,且保持細胞的理化穩(wěn)定性和膜結(jié)構完整性,為紅細胞的長期凍干保存奠定了基礎。 二、人紅細胞凍干保存中保護劑和凍干程序的優(yōu)化 第二部分中通過一系列對比實驗,比較了不同保護劑濃度組成和凍干程序中凍干前紅細胞降溫速率、擱板最低溫度、升華干燥和解析干燥不同的升溫速率等幾種參數(shù)的設置對紅細胞凍干復水后存活率的影響。 根據(jù)上述實驗結(jié)果,后續(xù)實驗中將選擇如下保護劑來凍干紅細胞:0.8mol/LGlycerol+15%PVP40+150mmol/L海藻糖+2%RSA,其pH為7.3,。凍干中采用液氮快速降溫,即將液氮噴濺于凍干瓶上,使之達到平衡,然后迅速取出放置到已經(jīng)預冷至-70℃的擱板上開始凍干。凍干程序為:升華干燥中,設定擱板溫度保持為-70℃1h、-60℃2h、-50℃2h、-40℃2h、-30℃2h、-25℃2h、-20℃2h、-15℃2h、解析干燥中,設定擱板溫度保持為-10℃1h、0℃1h、10℃2h,干燥腔體內(nèi)壓力設定為150mTorr～200mTorr(約20Pa～27 Pa)。冷凝器溫度為-85℃。整個干燥過程持續(xù)時間大約19個小時。 三、凍干人紅細胞復水條件的初步研究 本部分通過研究不同復水條件對凍干紅細胞回收率的影響,包括復水溶液、復水溫度、復水階段紅細胞胞體積變化速率(即蒸汽預復水)等,對凍干紅細胞復水條件的優(yōu)化進行初步研究,并檢測了凍干紅細胞復水后其各項理化功能的改變。 (1)不同復水條件對凍干紅細胞回收率的影響結(jié)果為:采用以PBS為基液配制的10%(w/v)PVP40溶液效果較好。比較不同復水溫度的影響,低于37℃時,紅細胞回收率隨著溫度的升高而增加,42℃比37℃略差,即37℃下復水效果最好。在加入復水液之前將樣品放置在37℃的飽和蒸汽環(huán)境中預復水能提高紅細胞回收率。并使細胞體積和體積分布寬度更接近于新鮮細胞數(shù)值。 (2)通過對復水后紅細胞理化性質(zhì)的研究,發(fā)現(xiàn)紅細胞的變形性較常規(guī)保存紅細胞有所下降,但胞內(nèi)ATP酶、G-6-PD酶、SOD和2,3-DPG的活性降低較少,大于紅細胞回收率,說明紅細胞在我們制備的凍干保護劑與設定的凍干過程下凍存后,細胞生化活性保存較好。同時也提示也提示對凍干復水過程中的細胞膜的保護還需進行更深入的研究。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2406597