【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)為微需氧、無芽孢的革蘭氏陰性彎曲短桿菌,是全球范圍內(nèi)人類感染性腹瀉常見的食源性病原菌。鞭毛不僅是其運動器官,更是主要的毒力因子,在C. jejuni黏附、定殖、侵入腸上皮細胞以及毒力蛋白分泌外輸過程中起重要作用。鞭毛輸出系統(tǒng)是鞭毛合成、裝配以及功能表現(xiàn)重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),大部分研究認為鞭毛輸出系統(tǒng)與革蘭氏陰性細菌的Ⅲ型毒力蛋白分泌系統(tǒng)在進化上是同源的,基因組分析以及相關(guān)的實驗研究初步顯示,鞭毛輸出系統(tǒng)很可能承擔(dān)了C. jejuniⅢ型毒力蛋白的轉(zhuǎn)運功能,與C. jejuni鞭毛致病性密切有關(guān)。 為了深入探索鞭毛輸出系統(tǒng)與鞭毛合成以及致病性關(guān)聯(lián)的分子機制,本課題運用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了C. jejuni鞭毛輸出系統(tǒng)關(guān)鍵基因flhA突變株(HXW001),并初步研究了flhA在毒力和分子調(diào)控方面的功能。 1、flhA插入失活突變株HXW001的構(gòu)建與鑒定 本研究使用插入失活的方法構(gòu)建空腸彎曲菌flhA突變株,首先在E.coil JM109中構(gòu)建敲除載體pMD19-T-flhA-kanr。其次,使用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入到空腸彎曲菌中,利用同源重組獲得突變株HXW001。 2、突變株致病相關(guān)表型的初步研究 主要包括生長性能、運動能力、菌體結(jié)構(gòu)、自身凝集性(Autoagglutination)、菌膜形成能力等,初步解析C. jejuni flhA與毒力的相關(guān)性。結(jié)果表明,flhA的缺失,對菌體的生長性能并無明顯影響,但是HXW001菌株的鞭毛缺失且喪失運動能力,生物膜形成能力和自身凝集現(xiàn)象明顯下降,說明flhA是鞭毛結(jié)構(gòu)和致病性重要的分子基礎(chǔ)。 3、flhA對鞭毛合成調(diào)節(jié)功能的初步研究 通過熒光定量PCR的方法研究了flhA對主要鞭毛絲蛋白基因flaA、調(diào)節(jié)基因fliA(σ28)和rpoN (σ54)在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)功能,結(jié)果顯示,flhA的缺失降低了鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaA和鞭毛合成第三級調(diào)節(jié)基因fliA的轉(zhuǎn)錄,對鞭毛合成第二級調(diào)節(jié)基因rpoN并無明顯的影響,表明flhA不僅與鞭毛蛋白輸出有關(guān),而且對鞭毛絲蛋白及其調(diào)節(jié)因子具有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控能力。 4、flhA與Ⅲ型毒力蛋白胞內(nèi)表達和胞外分泌相關(guān)性初步研究 首先通過熒光定量PCR的方法研究了flhA對Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的影響,結(jié)果表明,flhA并不影響Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平。其次研究了flhA對Ⅲ型毒力蛋白胞外分泌能力的影響,構(gòu)建ciaB原核表達系統(tǒng),并且制備和純化了CiaB蛋白,用于制備CiaB的多克隆抗體,便于今后運用Western blot的方法定性觀察flhA突變株HXW001與野生型在CiaB蛋白分泌能力上的差異程度。
[Abstract]:Campylobacter jejuni (Campylobacter jejuni) is a gram-negative short bacillus with microaerobic and no spores. It is a common foodborne pathogen of human infectious diarrhea worldwide. Flagella is not only its motor organ, but also the main virulence factor, which plays an important role in the adhesion, colonization, invasion of intestinal epithelial cells and secretion of virulence protein. The flagellum output system is an important structural basis for flagellum synthesis, assembly and functional expression. Most studies suggest that the flagellum output system is evolutionarily homologous to the type 鈪，

本文編號：2401862