發(fā)布時(shí)間：2018-12-27 14:32

【摘要】：脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要成分,具有一定的免疫活性。南極嗜冷細(xì)菌對(duì)極地海域極端環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng),已經(jīng)具備了獨(dú)特的生理生化特性,近幾年國(guó)內(nèi)外研究表明,極地細(xì)菌的組分成分及其代謝產(chǎn)物均具有較好的免疫活性。本實(shí)驗(yàn)室從南極海洋中分離得到一株典型的嗜冷菌,經(jīng)過(guò)鑒定命名為南極寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌AT82 (Alteromonas stellipolaris, AT82),簡(jiǎn)稱(chēng)AT82。前期的研究發(fā)現(xiàn),AT82脂多糖免疫注射黑鯛和大黃魚(yú)后,能顯著提高它們的白細(xì)胞吞噬活性、血清的抗菌活力和酚氧化酶活力,顯示出AT82 LPS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有一定的安全性和免疫增強(qiáng)活性。本試驗(yàn)將在此基礎(chǔ)上,研究AT82 LPS對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫的影響,期望為海洋經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)病害的生物防治和免疫增強(qiáng)劑的篩選提供參考,也為南極寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌生物活性物質(zhì)制劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。 1 AT82液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及其脂多糖提取方法的改良 以Zobell 2216E為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過(guò)對(duì)起始pH值,培養(yǎng)溫度,搖床轉(zhuǎn)速和接種量的研究,以菌體生長(zhǎng)量和脂多糖提取液中多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),得到AT82液體培養(yǎng)的最佳條件：起始pH 7.5,培養(yǎng)溫度8℃,搖床轉(zhuǎn)速150r/min,接種量5%,裝液量200mL／500mL三角瓶,培養(yǎng)時(shí)間5d,此條件下得到的菌體干重為0.064g。 在AT82脂多糖的提取方面,以傳統(tǒng)的酚水法為基礎(chǔ),在AT82菌懸液中增加溶菌酶(含50μg/mL)溫育1h,超聲波破碎30min, DNA酶和RNA酶(含50μg/mL)溫育1h后,脂多糖的得率從2.42%提高到6.73%,即從10g干菌體中可獲得0.673g粗脂多糖干粉。 2 AT82粗脂多糖及其滅活疫苗對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫的影響 本試驗(yàn)研究了通過(guò)體腔注射AT82粗LPS及其滅活菌體疫苗后,分別在第3、6、9、12d時(shí)對(duì)三疣梭子蟹抽血。通過(guò)分析免疫后不同處理組梭子蟹血清的抗菌活力、溶菌酶、酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、SOD酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力以及血細(xì)胞吞噬活力的變化,以研究它們對(duì)梭子蟹非特異性免疫功能的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組和生理鹽水組相比,滅活疫苗注射組(菌懸液濃度5×108cells/mL),低劑量LPS注射組(2mg/kg蟹體重)和高劑量LPS注射組(4mg/kg蟹體重)在第6、9d時(shí)可以顯著提高血清中溶菌酶、酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力以及抗菌活力,在第9、12d時(shí)可以顯著提高血清中SOD酶活力,第3、6d時(shí)可以顯著提高血細(xì)胞的吞噬活力(p0.05)。而且低劑量的LPS對(duì)抗菌活力,溶菌酶,酚氧化酶,酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力以及血細(xì)胞吞噬活力的增強(qiáng)效果要優(yōu)于高劑量的LPS和滅活疫苗,表明低劑量LPS的免疫增強(qiáng)效果可能會(huì)更好。 3 AT82粗脂多糖的分離純化 采用Cellulose DEAE-52柱層析法對(duì)AT82粗脂多糖進(jìn)了分離,采用SephadexG-100凝膠柱層析法對(duì)分離組分進(jìn)一步的純化。結(jié)果表明,AT82粗脂多糖上Cellulose DEAE-52層析柱,得到2個(gè)主要組分LPS1和LPS2,得率分別為29.38%和16.97%。取LPS1和LPS2經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析后,分別得到純組分LPS1a和LPS2a,得率分別為41.62%和26.31%。 4純組分LPSla和LPS2a的結(jié)構(gòu)分析 采用氣相色譜、凝膠滲透色譜、傅里葉變換紅外光譜等手段對(duì)LPS各純化組分的單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量及主要特征基團(tuán)等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,LPSla由鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成,分別占總糖的相對(duì)百分含量為33.69、21.13、0.54和34.85%。LPS2a由鼠李糖、木糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成,分別占總糖的相對(duì)百分含量為24.88、0.92、4.55、13.98、12.07和24.43%。紅外圖譜表明,兩者均存在呋喃糖環(huán)和β-糖苷鍵。凝膠滲透色譜分析表明,LPS1a為相對(duì)均一的多糖,相對(duì)分子質(zhì)量1.44×106,LPS2a為非均一多糖,其主要組分的相對(duì)分子質(zhì)量1.75×106。 5 AT82粗LPS及其純化組分的抗氧化活性和體外對(duì)小鼠免疫功能的影響 AT82粗脂多糖及其純化組分均能有效地清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基,可有效抑制試驗(yàn)小鼠肝組織和肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中丙二醛的產(chǎn)生,它們不僅能單獨(dú)刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,而且與ConA具有協(xié)同作用,并隨著劑量的不同呈現(xiàn)雙向性變化。研究還發(fā)現(xiàn),LPS1比LPS2有更好的抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)作用,這可能與LPS1的分子量較小,含有O-糖苷鍵、三螺旋結(jié)構(gòu)及較多的甘露糖和葡萄糖有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王穎群，，嚴(yán)共華;寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌[J];微生物學(xué)通報(bào);1995年05期

2 張崇邦,黃立南,欒天罡,藍(lán)崇鈺;寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌及其在環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2005年04期

3 潘惠霞;程爭(zhēng)鳴;張雪梅;牟書(shū)勇;齊曉玲;王方;;干旱荒漠區(qū)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌及其生態(tài)特性的研究[J];中國(guó)科學(xué).D輯:地球科學(xué);2006年S2期

4 邱東;程爭(zhēng)鳴;張?jiān)?吳楠;牟書(shū)勇;齊曉玲;潘惠霞;;寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌對(duì)古爾班通古特沙漠土壤環(huán)境的影響[J];干旱區(qū)研究;2012年01期

5 潘惠霞;程爭(zhēng)鳴;張?jiān)?張雪梅;牟書(shū)勇;;寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌(Oligographic bacteria)及其固沙作用的研究[J];中國(guó)沙漠;2007年03期

6 和振花;楊季芳;陳吉?jiǎng)?楊繼紅;;北極海水中可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌多樣性[J];海洋湖沼通報(bào);2011年04期

7 張雪梅;潘惠霞;程爭(zhēng)鳴;王純利;趙莉;;一株寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌胞外多糖的搖瓶發(fā)酵研究[J];微生物學(xué)通報(bào);2007年01期

8 趙家路;楊季芳;陳福生;;極地寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌AT52(Alteromonas stellipolaris sp.nov.)超微結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)生理特性及液態(tài)富營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化[J];極地研究;2011年03期

9 劉彬;戚向陽(yáng);楊季芳;;極地寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌(Alteromonas stellipolaris sp. nov.)色素的提取及其理化性質(zhì)的研究[J];海洋與湖沼;2010年01期

10 楊季芳;郭盧云;陳福生;王海麗;;2株南極海洋寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌(Alteromonas stellipolaris)脂多糖對(duì)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)非特異性免疫活性的影響[J];海洋與湖沼;2011年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 李明儒;低能N~+注入沙漠寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌及Monte-Carlo模擬[D];新疆大學(xué);2016年

2 劉彬;南極嗜冷寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌AT52（Alteromonas stellipolaris）色素的分離純化及其性質(zhì)的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 郭盧云;南極寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌AT82脂多糖的提取純化及其對(duì)三疣梭子蟹非特異性免疫的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 張雪梅;新疆干旱荒漠地區(qū)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌及其胞外多糖的研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 和振花;北極海水中可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究[D];華中師范大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2393217