【摘要】：鈣敏感受體（CaSR）屬G蛋白耦聯(lián)受體，在維持機(jī)體鈣穩(wěn)態(tài)中起重要作用，同時(shí)也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、基因表達(dá)和激素分泌等。肝臟缺血-再灌注損傷是肝手術(shù)過(guò)程中不可避免的，也是肝臟病學(xué)的研究熱點(diǎn)。但是鈣敏感受體在肝臟缺血-再灌注損傷中的作用及其機(jī)制，迄今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。 目的觀察大鼠在體肝臟缺血-再灌注損傷時(shí)CaSR的表達(dá)變化及與肝臟損傷的關(guān)系；CaSR在缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)BRL大鼠肝細(xì)胞系凋亡中的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法（1）采用門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈、膽管左支結(jié)扎和松結(jié)的方法，復(fù)制大鼠在體肝臟缺血-再灌注損傷模型，測(cè)定血清ALT、AST、SOD、NO活性和MDA含量；透射電鏡觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)變化；應(yīng)用RT-PCR、Western blot技術(shù)分別測(cè)定假手術(shù)組、缺血-再灌注1h、2h、4h和6h時(shí)肝臟組織中CaSRmRNA和蛋白的表達(dá)變化。（2）選擇BRL大鼠肝細(xì)胞系作為研究對(duì)象，采用RT-PCR、Western blot和免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)在BRL大鼠肝細(xì)胞系上有無(wú)CaSR mRNA和蛋白的表達(dá)及分布，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的實(shí)時(shí)變化，同時(shí)觀察GdCl3（CaSR的激動(dòng)劑）對(duì)上述指標(biāo)的影響。（3）BRL大鼠肝細(xì)胞系，在37℃條件下采用95％N2＋5％CO_2模擬缺血培養(yǎng)4小時(shí)后，更換為正常DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)10小時(shí)，建立BRL大鼠肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型。透射電鏡觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化；利用MTT比色法、Hoechest33342染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞存活率和凋亡率；激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定BRL細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]i的變化；以GdCl_3（CaSR的激動(dòng)劑）和NPS-2390（CaSR的抑制劑）作為干預(yù)因素, Western blot觀察BRL細(xì)胞CaSR的表達(dá),caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白的表達(dá),分析細(xì)胞色素c（Cyt-c）的釋放，觀察CaSR在細(xì)胞凋亡中的作用；Western blot檢測(cè)ERK和P38通路的蛋白表達(dá)，分析CaSR下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果（1）大鼠在體肝臟缺血-再灌注損傷時(shí)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)SOD的活性減低，ALT、AST、NO活性和MDA含量升高；肝臟超微結(jié)構(gòu)損傷加重；大鼠肝臟缺血-再灌注1h、2h肝組織CaSR的mRNA和蛋白表達(dá)升高，再灌注4h、6h后降低。（2）CaSR在BRL大鼠肝細(xì)胞系中有表達(dá)，并且主要分布在胞膜和胞漿中；增加細(xì)胞外鈣或者給予GdCl_3都可以引起細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且使CaSR的表達(dá)明顯增加；這種細(xì)胞內(nèi)鈣的增加可以被U73122（PLC的抑制劑），2-APB（IP_3受體的抑制劑）或者是毒胡蘿卜素（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵的抑制劑）所抑制甚至取消。（3）模擬缺氧-復(fù)氧后BRL細(xì)胞凋亡增加，BRL細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯, CaSR的蛋白表達(dá)明顯增加。GdCl_3能夠使缺氧-復(fù)氧所誘發(fā)的CaSR蛋白、線粒體通路凋亡蛋白，磷酸化ERK1/2和P38的蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，，[Ca~(2+)]_i增高，缺氧-復(fù)氧BRL細(xì)胞凋亡加重；NPS2390的作用相反。 結(jié)論（1）在體大鼠肝臟缺血-再灌注損傷模型中，CaSRmRNA和蛋白的表達(dá)在再灌注早期升高，晚期降低。肝組織損傷隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加劇。（2）在BRL大鼠肝細(xì)胞系中存在CaSR的表達(dá)，并且CaSR可通過(guò)PLC-IP_3通路介導(dǎo)BRL細(xì)胞內(nèi)鈣超載。（3）模擬缺氧-復(fù)氧BRL細(xì)胞模型中，CaSR激活線粒體途徑介導(dǎo)BRL細(xì)胞凋亡；同時(shí)啟動(dòng)MAPK通路發(fā)揮促凋亡和抑凋亡作用，但其促凋亡作用占主導(dǎo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2393103