【摘要】： Copines蛋白家族是近期發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化保守的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,該家族蛋白有兩個保守結(jié)構(gòu)域:N端兩個C2 domain,是結(jié)合鈣和磷脂的部位,已知蛋白激酶C、磷脂酶C和突觸結(jié)合蛋白等也有該結(jié)構(gòu)域;C端的A domain,類似于整合素(integrin)中的A domain,具有蛋白質(zhì)相互作用位點,是結(jié)合靶蛋白的結(jié)構(gòu)域。CPNE5定位于第6號染色體的6p21.1基因座,含一個1782bp的開放閱讀框,編碼593個氨基酸的蛋白。本研究主要圍繞CPNE5對TNF-a誘導(dǎo)的NF-kB轉(zhuǎn)錄激活活性的影響及其作用機(jī)制,以及CPNE5在細(xì)胞凋亡方面的作用進(jìn)行了研究。 在HEK293細(xì)胞中,TNF-a誘導(dǎo)CPNE5 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。含有NF-κB調(diào)控靶序列的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明,外源表達(dá)CPNE5能夠抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性。RT-PCR實驗顯示,過表達(dá)CPNE5抑制了NF-κB下游基因Bcl-2等在核酸水平的表達(dá)。為研究CPNE5保守區(qū)域A domain在CPNE5抑制NF-κB活性中的作用,我們構(gòu)建了C2結(jié)構(gòu)域缺失的AD(A domain)的GFP表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)AD-GFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)呈彌散表達(dá),不同于CPNE5的定位。我們發(fā)現(xiàn)AD的高表達(dá),可以顯著地抑制TNF-a所誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄激活活性,且這種抑制作用與AD轉(zhuǎn)染量具有劑量依賴性。這說明CPNE5的AD結(jié)構(gòu)域在其抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活中起到重要作用。 在發(fā)現(xiàn)CPNE5可以顯著抑制TNF-a對NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步對抑制機(jī)制進(jìn)行了研究。首先我們在HEK293細(xì)胞中建立了CPNE5的四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Tet-on)。經(jīng)過Zeocin篩選,我們挑取了7個pcDNATM 4/TO-CPNE5 T-Rex-293細(xì)胞克隆株。這些細(xì)胞株經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)12h~24h后,目的蛋白CPNE5有不同程度的表達(dá)。我們選取誘導(dǎo)表達(dá)量較高的細(xì)胞株,研究高表達(dá)CPNE5抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制。Western-blot結(jié)果顯示,CPNE5高表達(dá)并不影響NF-κB亞單位p65的入核。細(xì)胞免疫熒光實驗結(jié)果也驗證了這一結(jié)果,正常HEK293細(xì)胞中,TNF-a刺激能誘導(dǎo)NF-κB的快速入核。Western blot實驗和細(xì)胞免疫熒光實驗結(jié)果均表明,外源高表達(dá)CPNE5沒有阻止TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB入核。這些結(jié)果表明,CPNE5不通過NF-κB出入核調(diào)節(jié)機(jī)制來抑制NF-κB的活性。凝膠阻滯實驗結(jié)果表明,CPEN5過表達(dá)抑制了NF-κB的DNA結(jié)合活性。免疫共沉淀(co-IP)實驗結(jié)果表明,外源表達(dá)的CPNE5和NF-κB(P65)有相互作用。為研究CPNE5是否如CPNE1一樣可以剪切P65或P50,我們過表達(dá)CPNE5后再進(jìn)行TNF-a處理,Westernblot檢測未發(fā)現(xiàn)P65/P50有剪切體出現(xiàn),這表明CPNE5沒有如同家族的CPNE1一樣誘導(dǎo)P65或P50的剪切。 為研究外源表達(dá)CPNE5是否因為抑制了NF-κB的活性,從而抑制了TNF-a誘導(dǎo)的與細(xì)胞生存相關(guān)的信號通路,進(jìn)而促進(jìn)了TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,我們研究了外源表達(dá)CPNE5對TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。與空載體轉(zhuǎn)染組相比,外源表達(dá)CPNE5的HEK293細(xì)胞,在TNF-a作用后,細(xì)胞形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)特征性的凋亡改變,如細(xì)胞外形模糊、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞體積縮小等。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,TNF-a處理12h或24h時,實驗組細(xì)胞凋亡率高于對照組。分析介導(dǎo)凋亡的信號分子發(fā)現(xiàn),凋亡核心成員半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)的切割底物PARP參與了此過程。Western Blot結(jié)果表明,外源表達(dá)CPNE5促進(jìn)了PARP的剪切。以上結(jié)果表明,CPNE5可以在一定程度上促進(jìn)TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而外源表達(dá)CPNE5對CHX和TNF-a(-/+)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無顯著的影響。CHX是一種真核細(xì)胞蛋白翻譯的常見抑制劑,它可以通過抑制核糖體亞基肽轉(zhuǎn)移酶活性來阻止蛋白質(zhì)的合成。以上實驗結(jié)果表明CPNE5和CHX促進(jìn)TNF-a誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)有重疊,這提示二者促凋亡機(jī)制可能有類似之處,即通過抑制抗凋亡蛋白的合成促進(jìn)凋亡。 我們在檢測NF-κB下游基因時,發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象:無TNF-a誘導(dǎo)時,過表達(dá)CPNE5能夠顯著增強(qiáng)NF-κB下游基因Bcl-xL的蛋白表達(dá)水平。此時,NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性并沒有被激活。Bcl-xL屬于Bc1-2家族I類成員,具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,已有報道表明Bcl-xL也參與了TNF-a對NF-κB活性的調(diào)控。進(jìn)一步調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),Bcl-xL的表達(dá)除了受NF-κB調(diào)控外,還有很多因子可以調(diào)控它的表達(dá),其中重要的如STATs和Ets等。由此,我們推測過表達(dá)CPNE5可能通過一條不依賴NF-κB活性的信號通路促Bcl-xL表達(dá),而正由于Bcl-xL這種表達(dá)水平的升高,導(dǎo)致了盡管CPNE5有效地抑制了NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性,卻依然沒有顯著促進(jìn)NF-κB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為驗證這一設(shè)想,我們釣取了人Bcl-xL基因并將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,過表達(dá)Bcl-xL能夠抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活活性;轉(zhuǎn)染Bcl-xL的RNA干涉片段SiRNA-BclxL,降低了Bcl-xL的表達(dá)同時弱化CPNE5對NF-κB活性的抑制,表明Bcl-xL可能在CPNE5抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活活性過程中發(fā)揮重要的作用。 本研究內(nèi)容概括為:1.外源表達(dá)CPNE5抑制了TNF-a誘導(dǎo)了NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性;CPNE5的A結(jié)構(gòu)域也有這種抑制作用,并且呈現(xiàn)劑量依賴性;2. CPNE5不影響p65的出入核,表明CPNE5不通過NF-κB出入核調(diào)節(jié)機(jī)制來抑制NF-κB的活性,但CPEN5抑制了NF-κB與DNA結(jié)合的活性,且可以和P65相互作用;3. CPNE5促進(jìn)了TNF-a誘導(dǎo)的凋亡率增加;但對CHX或TNF-a/CHX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無影響;4.成功釣取Bcl-xL基因;發(fā)現(xiàn)CPNE5表達(dá)誘導(dǎo)Bcl-xL表達(dá)水平上調(diào);過表達(dá)Bcl-xL抑制NF-κB活性,SiRNA-BclxL弱化CPNE5對NF-κB活性的抑制,表明Bcl-xL可能參與CPNE5抑制NF-κB活性的過程。 我們的研究首次證明了CPNE5及其保守結(jié)構(gòu)域AD對NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活具有抑制作用,其機(jī)制為CPNE5抑制NF-κB DNA結(jié)合活性,且可能和CPNE5與P65的結(jié)合有關(guān)。我們也研究了CPNE5對細(xì)胞凋亡的影響。過表達(dá)CPNE5抑制NF-κB的活性且促進(jìn)凋亡。盡管過表達(dá)CPNE5也會上調(diào)Bcl-xL的表達(dá),但在整個TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中,過表達(dá)CPNE5總體上呈現(xiàn)促凋亡的效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 董波,饒亞嵐,魯茁壯,王瀾,從玉文,陳肖華,張軍權(quán),高榮蓮,王治東,毛秉智;一種新的GFP/DNA雙標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2004年06期

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本文編號：2391166