【摘要】：雖經(jīng)半個(gè)多世紀(jì)的不懈抗?fàn)?日本血吸蟲病(schistosomiasis japonica)迄今仍然是我國主要公共衛(wèi)生問題之一。近年來,采取的以傳染源控制為主的綜合防治策略,將重點(diǎn)置于對(duì)構(gòu)成我國現(xiàn)有疫區(qū)主要傳染源--牛的控制上,似乎已經(jīng)顯示出較好的防治效果,但基本上沒脫離以傳播生態(tài)學(xué)為原理的思維。防治實(shí)踐表明,依據(jù)疾病傳播生態(tài)學(xué)原理設(shè)計(jì)的綜合防治措施雖然有效,但效果難以鞏固,極易受到自然生態(tài)環(huán)境和防治投入力度變化的挑戰(zhàn)。鑒于疫苗在許多傳染病控制中無可比擬的作用,試圖發(fā)展血吸蟲疫苗,獲取化療“短效”作用與疫苗接種誘導(dǎo)較“長效”的免疫預(yù)防作用相結(jié)合的雙重效益來解決血吸蟲病控制的期盼是近20-30年來世界各國有關(guān)科學(xué)家為之奮斗的目標(biāo)之一,也是WHO/TDR自上世紀(jì)80年代以來在世界范圍內(nèi)協(xié)調(diào)血吸蟲病疫苗研制努力的初衷。 關(guān)于血吸蟲病疫苗發(fā)展及相關(guān)的血吸蟲病免疫學(xué)研究,大多集中在曼氏血吸蟲病(schistosomiasis mansoni),日本血吸蟲病疫苗發(fā)展研究還遠(yuǎn)滯后于曼氏血吸蟲病相關(guān)研究,尤其是相關(guān)的免疫學(xué)基礎(chǔ)研究更為薄弱。因此在努力研究和開發(fā)日本血吸蟲病疫苗的過程中,不僅要重視現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步所帶來的機(jī)遇,而且更重要的是要回歸到血吸蟲感染免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究,以尋覓血吸蟲病疫苗發(fā)展的合理策略和途徑。 在對(duì)曼氏血吸蟲病疫苗進(jìn)行研究的過程中,應(yīng)用效應(yīng)細(xì)胞、效應(yīng)分子的抗體拮抗及基因缺陷小鼠模型等對(duì)輻照致弱(RA)尾蚴疫苗進(jìn)行深入分析,發(fā)現(xiàn)對(duì)血吸蟲病的保護(hù)性免疫主要依賴于抗原特異性的CD4+ Th細(xì)胞應(yīng)答及體液免疫應(yīng)答。這些關(guān)于保護(hù)性免疫的研究均集中于獲得性免疫應(yīng)答的效應(yīng)端事件,而對(duì)天然免疫應(yīng)答的啟動(dòng)端事件則涉及較少。 迄今為止,在曼氏血吸蟲感染中有關(guān)天然免疫應(yīng)答的研究多集中在蟲卵抗原,闡明為何在產(chǎn)卵之后宿主呈現(xiàn)Th2型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。這些基于蟲卵抗原的研究,提示蟲源性分子可通過抗原特異性的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)級(jí)聯(lián)通路的靶向作用,啟動(dòng)并支配獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)展。由此不難推測(cè)在血吸蟲感染的早期,蟲源性抗原分子也會(huì)通過相應(yīng)PRRs通路引起類似的效應(yīng)。然而,國內(nèi)外尚缺乏全面深入地對(duì)日本血吸蟲感染后的天然免疫應(yīng)答特征及其相關(guān)分子機(jī)制研究的報(bào)道。鑒于Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)在宿主早期免疫識(shí)別中的重要作用,故在血吸蟲感染的天然免疫應(yīng)答研究中應(yīng)予特別關(guān)注。在對(duì)曼氏血吸蟲的研究中提示TLR2和TLR4是識(shí)別蟲卵抗原組分的PRRs,TLR4在識(shí)別尾蚴抗原分子中也發(fā)揮重要作用。因此,本研究旨在探討TLR2與TLR4在日本血吸蟲急性感染中的作用及相關(guān)分子機(jī)理。 本研究采用TLR2基因敲除(TLR2-/-)與TLR4基因發(fā)生無效突變的(C57BL/10SCNJ,即TLR4-/-)小鼠,前者以野生型C57BL/6J(B6)小鼠為對(duì)照,后者以野生型C57BL/10J(B10)小鼠為對(duì)照,建立日本血吸蟲急性感染的小鼠模型。為了觀察感染/致病結(jié)果,在感染后6w通過胸主動(dòng)脈灌注法計(jì)數(shù)成蟲數(shù)、消化肝臟計(jì)數(shù)蟲卵數(shù)以及每對(duì)成蟲產(chǎn)卵數(shù);為了觀察感染后宿主的整體免疫應(yīng)答特征,以間接ELISA法檢測(cè)血清中日本血吸蟲特異性IgG抗體,以Bio-plex技術(shù)檢測(cè)脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平;進(jìn)而采用Affymetrix公司的小鼠基因組430 2.0基因芯片,全面比較分析感染后6w小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生2倍及以上變化的差異基因進(jìn)行GO及pathway的顯著性分析,并以RTQ-PCR法加以驗(yàn)證;最后采用蟲源性抗原SEA致敏小鼠,觀察比較小鼠脾臟自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cells, NK細(xì)胞)與CD8+T細(xì)胞的免疫殺傷功能。 本研究獲得如下主要結(jié)果: 1、在日本血吸蟲急性感染過程中,與野生型小鼠相比,TLR2-/-小鼠蟲荷與卵荷均降低,而TLR4-/-小鼠的蟲荷與卵荷則增高。在日本血吸蟲感染后6w,TLR2-/-組的成蟲數(shù)、肝臟總蟲卵數(shù)以及每對(duì)成蟲產(chǎn)卵數(shù)均低于B6組;而與B10組相比,感染后TLR4-/-組小鼠的成蟲數(shù)、肝臟總蟲卵數(shù)以及每對(duì)成蟲產(chǎn)卵數(shù)均高于B10組。其中,僅成蟲數(shù)未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而肝臟總蟲卵數(shù)以及每對(duì)成蟲產(chǎn)卵數(shù)均具有顯著性差異。 2、在日本血吸蟲感染6w后,TLR2-/-小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平較B6小鼠顯著增強(qiáng),而TLR4-/-小鼠的細(xì)胞應(yīng)答水平低于B10小鼠。脾臟單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)蟲源性抗原SEA或有絲分裂原ConA刺激后,培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平顯示:在SEA和ConA刺激下,TLR2-/-小鼠產(chǎn)生IL-12p70、IFN-γ、IL-2、GM-CSF和IL-4的水平均較B6小鼠顯著增高;在ConA刺激下TNF-α和IL-10較高,而在SEA刺激下產(chǎn)生的IL-10低于B6小鼠。在SEA與ConA刺激后,TLR4-/-小鼠產(chǎn)生IL-12p70、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平均顯著低于B10小鼠;在單獨(dú)ConA刺激下IL-10顯著降低,而在SEA刺激后,TNF-α顯著降低。其余細(xì)胞因子在TLR4-/-亦低于B10小鼠,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。 3、日本血吸蟲感染后,TLR4-/-小鼠抗原特異性IgG水平顯著高于B10小鼠,但TLR2-/-小鼠與B6小鼠之間無顯著差異。隨著日本血吸蟲感染的發(fā)展,小鼠血清中日本血吸蟲特異性IgG抗體水平均持續(xù)升高。在感染后3w和6w,TLR4-/-小鼠血清中針對(duì)可溶性成蟲抗原(SWAP)和SEA特異的IgG抗體水平顯著高于B10組;但TLR2-/-與B6小鼠之間無顯著性差異。 4、采用高通量基因芯片技術(shù)分析比較日本血吸蟲感染6w后脾臟單個(gè)核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)TLR2-/-小鼠中與T細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的大量基因以及免疫殺傷功能相關(guān)的基因(顆粒酶、穿孔素、FasL等)被顯著上調(diào);而在TLR4-/-小鼠中,這兩大類基因的表達(dá)均被顯著下調(diào)。與B6小鼠相比,在感染后6w的TLR2-/-小鼠脾細(xì)胞中,有251個(gè)基因信號(hào)有顯著性改變,并且信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)2倍以上,444個(gè)基因信號(hào)減弱2倍以上;在TLR4-/-小鼠脾細(xì)胞中,僅有91個(gè)基因信號(hào)增強(qiáng)2倍以上,同時(shí)121個(gè)基因信號(hào)減弱2倍以上。值得注意的是,在TLR2-/-小鼠中信號(hào)增強(qiáng)的基因在TLR4-/-小鼠中大多減弱。對(duì)差異基因的GO分類及pathway的顯著性分析發(fā)現(xiàn),差異基因及參與的通路主要涉及兩大類:一是T細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)基因及通路,二是免疫殺傷相關(guān)基因及通路。 5、經(jīng)SEA致敏后,TLR2-/-和TLR4-/-小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活性均略高于野生型小鼠,但無顯著性差異;相較于野生型小鼠,CD8+T細(xì)胞殺傷功能相關(guān)基因mRNA水平在TLR2-/-小鼠中升高,在TLR4-/-小鼠中降低。經(jīng)SEA致敏后,TLR2-/-和TLR4-/-小鼠脾臟CD49b+NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞的殺傷活性均略高于野生型小鼠,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TLR2-/-小鼠CD8+T細(xì)胞中免疫殺傷功能相關(guān)基因(gzma、gzmb、gzmk、pfr1以及fasl)的mRNA水平高于B6小鼠,其中pfr1具有顯著性差異;而TLR4-/-小鼠CD8+T細(xì)胞中g(shù)zma、gzmb和fasl的mRNA水平均顯著低于B10小鼠。 綜上,感染日本血吸蟲后,與野生型小鼠相比,TLR2-/-小鼠與TLR4-/-小鼠在感染結(jié)果、T細(xì)胞免疫應(yīng)答程度以及免疫殺傷功能等方面均明顯不同,表明TLR2與TLR4對(duì)血吸蟲感染轉(zhuǎn)歸的影響與T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及免疫殺傷功能相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2391261