【摘要】： 神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病仍是困擾人類健康的重要疾病,目前,細(xì)胞移植治療是較為理想的治療方法,然而移植細(xì)胞來源(例如神經(jīng)元或胰島)的匱乏限制了這一治療手段的廣泛開展。干細(xì)胞由于其具有自我更新及多向分化潛能為提供優(yōu)良的種子細(xì)胞帶來了新的希望。在眾多干細(xì)胞中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有易于獲取、多向分化能力、無倫理學(xué)爭議、免疫排斥低等優(yōu)點(diǎn),是進(jìn)行細(xì)胞移植的理想種子細(xì)胞。但是目前關(guān)于MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元或胰島細(xì)胞仍然存在很多問題,如分化效率不高、分化細(xì)胞功能不完善、分化機(jī)制不明確等。進(jìn)一步闡明MSCs向神經(jīng)元和胰島細(xì)胞分化的機(jī)制,提高誘導(dǎo)效率是本課題的研究目的。通過文獻(xiàn)調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元限制性沉默因子在干細(xì)胞向神經(jīng)和胰島分化過程中可能發(fā)揮了重要作用。 神經(jīng)元限制性沉默因子(neuronal restrictive silencing factor,NRSF),也被稱為REST(repressor element silencing transcription factor),屬于具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的Cys2-His2鋅指蛋白Gli-Kruppel家族,是一個116kD的鋅指蛋白。在NRSF的N端有八個鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu),其后緊隨的區(qū)域為富含脯氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu),在C端還有一個鋅指結(jié)構(gòu)。缺失體及GAL-4融合分析證實(shí)NRSF有兩個獨(dú)立的阻遏區(qū)域,分別位于兩端,NRSF鋅指結(jié)構(gòu)6～8主要發(fā)揮與靶基因DNA序列結(jié)合的功能,鋅指結(jié)構(gòu)2～5主要發(fā)揮核定位的作用。NRSF通過和一段稱為NRSE(neuronal restrictive silencer element)的DNA序列結(jié)合,招募組蛋白去乙�；�(histone deacetylases,HDAC)使組蛋白去乙�；瘡亩种苹虻谋磉_(dá),NRSF因此抑制多種神經(jīng)元特異性基因的表達(dá),包括離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子、激素及調(diào)控軸突生長、囊泡運(yùn)輸及釋放的因子等。NRSF廣泛表達(dá)于胚胎干細(xì)胞及成體細(xì)胞中,僅在成熟神經(jīng)元和胰島細(xì)胞中沒有表達(dá)。 研究發(fā)現(xiàn),NRSF在干細(xì)胞的干性維持及發(fā)育分化中有著重要作用,在神經(jīng)干細(xì)胞中抑制NRSF的表達(dá)可以激活多種神經(jīng)元特異表達(dá)的基因,這些基因的表達(dá)有助于促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N18中采用RNA干涉的方法降低NRSF表達(dá)成功地誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)突觸。NRSF還可以通過抑制miRNA-21的表達(dá)來維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和全能性。在神經(jīng)發(fā)育過程中NRSF的表達(dá)下調(diào)具有重要意義,在神經(jīng)元中外源性過表達(dá)NRSF將抑制神經(jīng)元特異基因的表達(dá)并導(dǎo)致神經(jīng)軸突導(dǎo)向錯誤。 我們的研究發(fā)現(xiàn)MSCs高表達(dá)NRSF蛋白,提示NRSF可能在維持MSCs的干性中也發(fā)揮了作用。為進(jìn)一步明確NRSF在MSCs分化中的作用,在本實(shí)驗中,我們通過RNA干涉技術(shù),下調(diào)MSCs內(nèi)源NRSF表達(dá)進(jìn)行并分析干涉NRSF后MSCs向神經(jīng)元和胰島細(xì)胞分化的能力。 我們首先構(gòu)建了能夠穩(wěn)定干涉人NRSF的慢病毒干涉載體,并在HeLa細(xì)胞中對其進(jìn)行干涉效果和功能的鑒定。結(jié)果表明:所構(gòu)建的干涉載體在HeLa細(xì)胞中能夠穩(wěn)定降低NRSF的mRNA和蛋白表達(dá)水平,干涉NRSF可以有效啟動其靶基因如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、神經(jīng)元特異性生長相關(guān)蛋白SCG10、配對盒基因pax4以及胰島素insulin等的表達(dá)。同時通過胰島素基因啟動子-螢火蟲熒光素酶報告系統(tǒng)證實(shí),干涉NRSF后胰島素基因啟動子的活性明顯增強(qiáng)。 在此基礎(chǔ)上,我們利用NRSF慢病毒干涉載體感染MSCs,同樣發(fā)現(xiàn):NRSF慢病毒干涉載體能夠降低MSCs中NRSF mRNA和蛋白水平的表達(dá),通過脫靶對照實(shí)驗證明這種干涉效果并未引起RNA干涉的脫靶效應(yīng)。在MSCs的正常培養(yǎng)條件(低糖DMEM+10%胎牛血清)下,感染NRSF干涉病毒的MSCs( MSCs-siNRSF )生長速度明顯低于感染脫靶對照病毒的MSCs(MSCs-siControl)。培養(yǎng)7天后可見MSCs-siNRSF生長出神經(jīng)元樣的突觸結(jié)構(gòu),14天后,這些突觸進(jìn)一步伸展,細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣的結(jié)構(gòu),而MSCs-siControl并無明顯的形態(tài)變化。RT-PCR結(jié)果顯示,分化后的MSCs-siNRSF表達(dá)SCG10、BDNF、突觸素SYP、神經(jīng)元烯醇化酶NSE和神經(jīng)營養(yǎng)素NGN3,但不表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP。免疫熒光染色結(jié)果表明,分化細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異蛋白如β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、NSE、BDNF和微管相關(guān)蛋白2(MAP2)等,但不表達(dá)GFAP和少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Olig2。更重要的是,膜片鉗實(shí)驗進(jìn)一步證明了這些分化細(xì)胞具有TTX敏感的Na+電流和動作電位。上述結(jié)果表明,NRSF干涉可促進(jìn)MSCs分化為不含膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)元樣細(xì)胞,這些分化細(xì)胞不僅具有神經(jīng)元樣的形態(tài),表達(dá)神經(jīng)元特異性的蛋白,還具有神經(jīng)元的功能。 NRSF在胰腺發(fā)育可能也發(fā)揮著重要的作用。在胰島素瘤細(xì)胞系中過表達(dá)NRSF會破壞其葡萄糖-胰島素分泌偶聯(lián)機(jī)制,而在胰島β細(xì)胞中表達(dá)NRSF則導(dǎo)致葡萄糖耐受和β細(xì)胞數(shù)目減少。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在胰高血糖素GLP-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF存在的條件下,干涉NRSF有助于MSCs分化為胰島樣細(xì)胞,這些分化細(xì)胞表達(dá)胰島素mRNA,雙硫腙(DTZ)染色陽性,但還需要進(jìn)一步研究以確定其功能。 綜上所述,干涉NRSF能夠使MSCs向神經(jīng)元自發(fā)分化,在特定條件下,這些細(xì)胞能夠分化為胰島樣的細(xì)胞。這些研究結(jié)果不僅有利于進(jìn)一步分析NRSF在神經(jīng)及胰島發(fā)育中的機(jī)制,而且提供了一種產(chǎn)生神經(jīng)元和胰島細(xì)胞的新方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉慶斌;李艷華;楊印祥;袁紅豐;張銳;秦立蓬;呂洋;張賽男;孫迪金;陳琳;白慈賢;南雪;王韞芳;裴雪濤;;神經(jīng)元限制性沉默因子對人胰島素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年09期

2 楊印祥;李艷華;劉慶斌;張賽男;陳琳;呂洋;白慈賢;南雪;裴雪濤;;NRSF慢病毒干涉載體的構(gòu)建及功能初步檢測[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年02期

，

本文編號：2374314