【摘要】：胞漿游離鈣離子([Ca~(2+)]i)可作為重要的第二信使在細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用。鈣離子在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能上具有多樣性,包括細(xì)胞的黏附、位移、基因表達(dá)、增殖分化。然而,單一的鈣離子是如何實(shí)現(xiàn)其功能的特異性呢?這是有關(guān)鈣信號(hào)研究的熱點(diǎn)話題。鈣離子濃度升高可表現(xiàn)為多種形式:一過(guò)性鈣離子濃度升高,持續(xù)性鈣離子濃度升高,振蕩形式的鈣離子濃度升高。其中鈣振蕩(calcium oscillation)是胞內(nèi)普遍存在的一種信息模式。鈣振蕩(calcium oscillation)在運(yùn)動(dòng)形式上表現(xiàn)為多參數(shù):振幅、頻率、持續(xù)時(shí)間等。1998年Lewis等人應(yīng)用鈣鉗制技術(shù)證明了人工鈣振蕩頻率的變化可特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、NF-AT、OCT/OAP的轉(zhuǎn)錄活性,并可提高鈣離子的工作效率。1999年Hu利用XeC下調(diào)組胺誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣振蕩頻率,首次證明了受體介導(dǎo)鈣振蕩頻率可特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。鈣振蕩的頻率變化特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的觀點(diǎn)已被廣泛接受。然而,頻率依賴性的機(jī)制是什么呢?經(jīng)仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn),頻率的變化在形式上表現(xiàn)為單位時(shí)間內(nèi)胞漿鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)升高與回落的次數(shù)的多少。高頻鈣振蕩時(shí),胞漿鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)在單位時(shí)間內(nèi)升高與回落的次數(shù)多,鈣離子在某一濃度持續(xù)的累積時(shí)間長(zhǎng),低頻鈣振蕩時(shí)與之相反。在生理或病理生理?xiàng)l件下,某些細(xì)胞或組織間斷釋放細(xì)胞因子(組胺等),以旁分泌或自分泌的形式發(fā)揮作用,從而引起細(xì)胞鈣信號(hào)的產(chǎn)生亦是間斷性的。 據(jù)此推測(cè),鈣振蕩頻率變化的本質(zhì)與累積波寬(鈣離子在某一濃度持續(xù)的累積時(shí)間)有關(guān)。在此,本項(xiàng)研究應(yīng)用組胺間斷刺激人氣道上皮細(xì)胞16HBE產(chǎn)生鈣振蕩,建立振幅、頻率相同而累積波寬不同和振幅、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型,并對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)振幅、累積波寬相同而頻率不同時(shí),NF-κB的活性的活性相同;振幅、頻率相同而累積波寬不同時(shí),NF-κB的活性的活性亦不相同。由此證明了鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄的本質(zhì)是累積波寬。 目的 本研究通過(guò)組胺間斷刺激在人氣道上皮細(xì)胞建立振幅、頻率相同而累積波寬不同和振幅、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型,并對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性的進(jìn)行檢測(cè),研究鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)下游生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制。 方法 1.利用本實(shí)驗(yàn)室自行研制的全自動(dòng)顯微灌流控制系統(tǒng)使有組胺灌流液和無(wú)組胺灌液交替對(duì)細(xì)胞進(jìn)行灌流,細(xì)胞標(biāo)記有鈣離子熒光指示劑Fura-2 ,在灌流的同時(shí)利用鈣離子成像系統(tǒng)對(duì)鈣離子濃度變化進(jìn)行監(jiān)測(cè),建立鈣振蕩模型。 2.利用本室自行研制的全自動(dòng)顯微灌流控制系統(tǒng)使有組胺灌流液和無(wú)組胺灌流液交替對(duì)細(xì)胞進(jìn)行灌流,復(fù)制鈣振蕩模型。細(xì)胞經(jīng)不同鈣振蕩處理后,用基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)方法檢測(cè)NF-κB活性。 結(jié)果 1.在100秒(s)、200s、300s內(nèi)用組胺濃度為10μmmol的灌流液分別作用于細(xì)胞20s、40s、60s,總灌流時(shí)間為45分鐘(min)。三種鈣振蕩的振幅分別為(467.1±57.1)nmol/L(n=21)、(466.8±84.6)nmol/L(n=28)、(467.9±73.2)nnmol/L(n=38),振幅無(wú)顯著性差異(p0.05)。頻率分別為0.6次/分鐘(min-1)、0.3(min-1)、0.2(min-1)。波寬分別為(18.1±1.6)s(n=13)、(36.0±3.0)s(n=17)、(54.6±2.5)s(n=17)。在45 min的灌流時(shí)間內(nèi),三種頻率的鈣振蕩的累積波寬相同,均為486s;組胺刺激的總時(shí)間亦相同,均為540s。由此建立了振幅相同、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型。隨后,改變灌流條件,在100s內(nèi)用組胺濃度為10μmmol的灌流液作用于細(xì)胞30s,灌流液中鈣離子的濃度依次為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,總灌流時(shí)間為45 min。三種鈣振蕩的振幅分別為(466.7±58.6)nmol/L(n=29)、(465.3±52.8)nmol/L(n=31)、(466.8±84.5)nmol/L(n=28) ,振幅無(wú)顯著性差異(p0.05)。波寬分別為(15.3±1.9)(sn=18)、(20.4±4.1)(sn=24)、(29.6±4.7)(sn=28),波寬的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。三種鈣振蕩的頻率均為0.6 min-1。由此建立了振幅相同、頻率相同而累積波寬不同的鈣振蕩模型。以同樣的方式建立頻率分別為0.3 min-1、0.2min-1振幅相同、頻率相同而累積波寬不同的鈣振蕩模型。 2.(1)振幅相同、累積波寬相同,頻率不同的鈣振蕩對(duì)NF-κB活性的影: 用含有10μmmol組胺的灌流液在100s、200s、300s內(nèi)分別作用于細(xì)胞20s、40s、60s,總灌流時(shí)間為45 min。NF-κB的活性分別為(184.7±22.7)%、(157.8±9.1)%、(158.3±12.7)%,空白對(duì)照組的活性為100%,三種條件下與空白對(duì)照組相比,活性均有明顯升高(p0.05),但三組之間活性無(wú)顯著性差異(p0.05)。 (2)振幅相同、頻率相同,累積波寬不同的鈣振蕩對(duì)NF-κB活性的影: 用含有10μmmol組胺的灌流液在100s內(nèi)作用于細(xì)胞30s,分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三種不同的灌流液作用,總灌流時(shí)間為45 min。NF-κB的活性分別為(144.4±6.1)%、(209.1±22.2)%、(394.3±65.4)%,空白對(duì)照組的活性為100%,三種條件下與空白對(duì)照組相比,活性均有明顯升高(p0.05),三組間的活性有顯著性差別(p0.05)。用含有10μmmol組胺的灌流液在200s內(nèi)作用于細(xì)胞30s,分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三種不同的灌流液作用,總灌流時(shí)間為45 min。NF-κB的活性分別為(126.7±12.2)%、(147.6±13.9)%、(198.6±26.3)%。空白對(duì)照組的活性為100%,三種條件下與空白對(duì)照組相比,活性均有明顯升高(p0.05)。其中1.0mmol組和1.5mmol組NF-κB活性的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);1.0mmol組和2.0mmol組NF-κB活性的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05), 1.5mmol組和2.0mmol組NF-κB活性的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。用含有10μmmol組胺的灌流液在300s內(nèi)作用于細(xì)胞30s,分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三種不同的灌流液作用,總灌流時(shí)間為45 min。NF-κB的活性分別為(111.4±7.0)%、(113.0±3.2)%、(119.6±9.8)% ,三種條件下與空白對(duì)照組相比,活性均有明顯升高(p0.05)。三組間兩兩比較NF-κB活性的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。組間對(duì)照用無(wú)組胺灌流液灌流細(xì)胞,鈣離子濃度分別為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,三組間NF-κB的活性無(wú)顯著性差異(p0.05)。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)在人氣道上皮細(xì)胞中成功地建立了振幅、頻率相同,累積波寬不同以及振幅、累積波寬相同,頻率不同的鈣振蕩模型。為研究鈣振蕩如何調(diào)節(jié)NF-κB活性奠定了基礎(chǔ)。 鈣振蕩調(diào)節(jié)NF-κB的活性,在振幅、累積波寬相同,頻率不同時(shí),NF-κB的活性無(wú)明顯差異;在振幅、頻率相同,累積波寬不同時(shí),NF-κB的活性有顯著性差異。由此證明了鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)下游生物學(xué)效應(yīng)的本質(zhì)是累積波寬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2374472