發(fā)布時間：2018-12-12 11:21

【摘要】：胞漿游離鈣離子([Ca~(2+)]i)可作為重要的第二信使在細胞功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用。鈣離子在調(diào)節(jié)細胞功能上具有多樣性,包括細胞的黏附、位移、基因表達、增殖分化。然而,單一的鈣離子是如何實現(xiàn)其功能的特異性呢?這是有關鈣信號研究的熱點話題。鈣離子濃度升高可表現(xiàn)為多種形式:一過性鈣離子濃度升高,持續(xù)性鈣離子濃度升高,振蕩形式的鈣離子濃度升高。其中鈣振蕩(calcium oscillation)是胞內(nèi)普遍存在的一種信息模式。鈣振蕩(calcium oscillation)在運動形式上表現(xiàn)為多參數(shù):振幅、頻率、持續(xù)時間等。1998年Lewis等人應用鈣鉗制技術證明了人工鈣振蕩頻率的變化可特異性調(diào)節(jié)轉錄因子NF-κB、NF-AT、OCT/OAP的轉錄活性,并可提高鈣離子的工作效率。1999年Hu利用XeC下調(diào)組胺誘導人主動脈內(nèi)皮細胞鈣振蕩頻率,首次證明了受體介導鈣振蕩頻率可特異性調(diào)節(jié)轉錄因子NF-κB的活性。鈣振蕩的頻率變化特異性調(diào)節(jié)細胞功能的觀點已被廣泛接受。然而,頻率依賴性的機制是什么呢?經(jīng)仔細觀察發(fā)現(xiàn),頻率的變化在形式上表現(xiàn)為單位時間內(nèi)胞漿鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)升高與回落的次數(shù)的多少。高頻鈣振蕩時,胞漿鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)在單位時間內(nèi)升高與回落的次數(shù)多,鈣離子在某一濃度持續(xù)的累積時間長,低頻鈣振蕩時與之相反。在生理或病理生理條件下,某些細胞或組織間斷釋放細胞因子(組胺等),以旁分泌或自分泌的形式發(fā)揮作用,從而引起細胞鈣信號的產(chǎn)生亦是間斷性的。 據(jù)此推測,鈣振蕩頻率變化的本質(zhì)與累積波寬(鈣離子在某一濃度持續(xù)的累積時間)有關。在此,本項研究應用組胺間斷刺激人氣道上皮細胞16HBE產(chǎn)生鈣振蕩,建立振幅、頻率相同而累積波寬不同和振幅、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型,并對下游轉錄因子NF-κB的活性進行測定。發(fā)現(xiàn)振幅、累積波寬相同而頻率不同時,NF-κB的活性的活性相同;振幅、頻率相同而累積波寬不同時,NF-κB的活性的活性亦不相同。由此證明了鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)受體介導激活轉錄的本質(zhì)是累積波寬。 目的 本研究通過組胺間斷刺激在人氣道上皮細胞建立振幅、頻率相同而累積波寬不同和振幅、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型,并對下游轉錄因子NF-κB的活性的進行檢測,研究鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)下游生物學效應的內(nèi)在機制。 方法 1.利用本實驗室自行研制的全自動顯微灌流控制系統(tǒng)使有組胺灌流液和無組胺灌液交替對細胞進行灌流,細胞標記有鈣離子熒光指示劑Fura-2 ,在灌流的同時利用鈣離子成像系統(tǒng)對鈣離子濃度變化進行監(jiān)測,建立鈣振蕩模型。 2.利用本室自行研制的全自動顯微灌流控制系統(tǒng)使有組胺灌流液和無組胺灌流液交替對細胞進行灌流,復制鈣振蕩模型。細胞經(jīng)不同鈣振蕩處理后,用基于ELISA的轉錄因子活性檢測方法檢測NF-κB活性。 結果 1.在100秒(s)、200s、300s內(nèi)用組胺濃度為10μmmol的灌流液分別作用于細胞20s、40s、60s,總灌流時間為45分鐘(min)。三種鈣振蕩的振幅分別為(467.1±57.1)nmol/L(n=21)、(466.8±84.6)nmol/L(n=28)、(467.9±73.2)nnmol/L(n=38),振幅無顯著性差異(p0.05)。頻率分別為0.6次/分鐘(min-1)、0.3(min-1)、0.2(min-1)。波寬分別為(18.1±1.6)s(n=13)、(36.0±3.0)s(n=17)、(54.6±2.5)s(n=17)。在45 min的灌流時間內(nèi),三種頻率的鈣振蕩的累積波寬相同,均為486s;組胺刺激的總時間亦相同,均為540s。由此建立了振幅相同、累積波寬相同而頻率不同的鈣振蕩模型。隨后,改變灌流條件,在100s內(nèi)用組胺濃度為10μmmol的灌流液作用于細胞30s,灌流液中鈣離子的濃度依次為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,總灌流時間為45 min。三種鈣振蕩的振幅分別為(466.7±58.6)nmol/L(n=29)、(465.3±52.8)nmol/L(n=31)、(466.8±84.5)nmol/L(n=28) ,振幅無顯著性差異(p0.05)。波寬分別為(15.3±1.9)(sn=18)、(20.4±4.1)(sn=24)、(29.6±4.7)(sn=28),波寬的差別有統(tǒng)計學意義(p0.05)。三種鈣振蕩的頻率均為0.6 min-1。由此建立了振幅相同、頻率相同而累積波寬不同的鈣振蕩模型。以同樣的方式建立頻率分別為0.3 min-1、0.2min-1振幅相同、頻率相同而累積波寬不同的鈣振蕩模型。 2.(1)振幅相同、累積波寬相同,頻率不同的鈣振蕩對NF-κB活性的影: 用含有10μmmol組胺的灌流液在100s、200s、300s內(nèi)分別作用于細胞20s、40s、60s,總灌流時間為45 min。NF-κB的活性分別為(184.7±22.7)%、(157.8±9.1)%、(158.3±12.7)%,空白對照組的活性為100%,三種條件下與空白對照組相比,活性均有明顯升高(p0.05),但三組之間活性無顯著性差異(p0.05)。 (2)振幅相同、頻率相同,累積波寬不同的鈣振蕩對NF-κB活性的影: 用含有10μmmol組胺的灌流液在100s內(nèi)作用于細胞30s,分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三種不同的灌流液作用,總灌流時間為45 min。NF-κB的活性分別為(144.4±6.1)%、(209.1±22.2)%、(394.3±65.4)%,空白對照組的活性為100%,三種條件下與空白對照組相比,活性均有明顯升高(p0.05),三組間的活性有顯著性差別(p0.05)。用含有10μmmol組胺的灌流液在200s內(nèi)作用于細胞30s,分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三種不同的灌流液作用,總灌流時間為45 min。NF-κB的活性分別為(126.7±12.2)%、(147.6±13.9)%、(198.6±26.3)%�？瞻讓φ战M的活性為100%,三種條件下與空白對照組相比,活性均有明顯升高(p0.05)。其中1.0mmol組和1.5mmol組NF-κB活性的差別無統(tǒng)計學意義(p0.05);1.0mmol組和2.0mmol組NF-κB活性的差別有統(tǒng)計學意義(p0.05), 1.5mmol組和2.0mmol組NF-κB活性的差別有統(tǒng)計學意義(p0.05)。用含有10μmmol組胺的灌流液在300s內(nèi)作用于細胞30s,分別用鈣離子濃度為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三種不同的灌流液作用,總灌流時間為45 min。NF-κB的活性分別為(111.4±7.0)%、(113.0±3.2)%、(119.6±9.8)% ,三種條件下與空白對照組相比,活性均有明顯升高(p0.05)。三組間兩兩比較NF-κB活性的差別無統(tǒng)計學意義(p0.05)。組間對照用無組胺灌流液灌流細胞,鈣離子濃度分別為1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,三組間NF-κB的活性無顯著性差異(p0.05)。 結論 本實驗在人氣道上皮細胞中成功地建立了振幅、頻率相同,累積波寬不同以及振幅、累積波寬相同,頻率不同的鈣振蕩模型。為研究鈣振蕩如何調(diào)節(jié)NF-κB活性奠定了基礎。 鈣振蕩調(diào)節(jié)NF-κB的活性,在振幅、累積波寬相同,頻率不同時,NF-κB的活性無明顯差異;在振幅、頻率相同,累積波寬不同時,NF-κB的活性有顯著性差異。由此證明了鈣振蕩頻率調(diào)節(jié)下游生物學效應的本質(zhì)是累積波寬。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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