【摘要】：背景:近年來，隨著院內(nèi)嚴(yán)重免疫缺陷患者數(shù)量的增加，侵襲性曲霉病已成為血液病房、器官移植中心及重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因，曲霉已成為僅次于念珠菌的一個(gè)重要的致病菌。而在致病曲霉中煙曲霉(A.fumigatus)是最主要的致病菌。由于不同國(guó)家和地區(qū)存在不同的優(yōu)勢(shì)致病菌株，采用分子系統(tǒng)學(xué)的方法對(duì)各個(gè)地區(qū)的致病煙曲霉進(jìn)行研究有助于確定致病株流行特征與曲霉種群的關(guān)系。目的:1）以我國(guó)北京、上海、福建及河北臨床分離到的煙曲霉為研究對(duì)象，分別通過形態(tài)學(xué)、鏡下特點(diǎn)、溫度試驗(yàn)及β-tubulin分子生物學(xué)方法鑒定后，再對(duì)煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型，從而了解我國(guó)不同地域致病煙曲霉臨床分離株分布情況。2）檢測(cè)臨床分離到的煙曲霉對(duì)不同抗真菌藥物的體外敏感性，為臨床治療和采取預(yù)防措施提供有意義的線索和指導(dǎo)，并比較不同基因型之間及不同地區(qū)之間的煙曲霉的體外抗真菌藥物敏感性是否有差異。 方法：本研究對(duì)我國(guó)北京、上海、福建及河北收集到的112株煙曲霉臨床分離株分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)、溫度試驗(yàn)及分子生物學(xué)測(cè)序鑒定后，再對(duì)煙曲霉進(jìn)行細(xì)胞表面蛋白（Cell surface protein，CSP）基因分型。本研究所用到的形態(tài)學(xué)方法主要包括觀察培養(yǎng)菌落形態(tài)、培養(yǎng)后經(jīng)乳酸酚棉蘭染色鏡檢。溫度試驗(yàn)：將通過形態(tài)學(xué)方法初步鑒定出的煙曲霉菌株點(diǎn)植于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextroseagar，PDA)上分別置于48℃、45℃、42℃及37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，觀察菌落是否生長(zhǎng)，從而鑒定至不同的分支。本研究采用玻璃珠破壁、酚-氯仿-異戊醇抽提法提取基因組DNA，然后對(duì)β-tubulin進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)該區(qū)進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用mega5.0軟件對(duì)測(cè)序所得DNA堿基序列進(jìn)行編輯，與Genbank數(shù)據(jù)庫中的序列比對(duì)，以此鑒定曲霉菌種，最后對(duì)鑒定出的煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型，從而了解我國(guó)不同地域致病煙曲霉臨床株分布情況。同時(shí)參照2003年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National committee for clinical laboratory standards，NCCLS）制定的產(chǎn)孢絲狀真菌抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案（M38-A）測(cè)定伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B對(duì)煙曲霉的最低抑菌濃度(Minimal InhibitoryConcentration，MIC)，以探討不同基因型煙曲霉與抗真菌藥物的敏感性關(guān)系，同時(shí)比較不同地區(qū)的煙曲霉對(duì)抗真菌藥物的敏感性是否有差異。 結(jié)果：112株臨床分離到的曲霉菌株在PDA的菌落特征和顯微鏡下特征均符合煙曲霉特征，所有菌株在48℃均能生長(zhǎng)，并經(jīng)β-tubulin測(cè)序，與Genbank中多株煙曲霉序列相比呈98%以上一致性，表明都為經(jīng)典煙曲霉。經(jīng)典煙曲霉經(jīng)CSP引物擴(kuò)增后均生成單一條帶約610bp，采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化命名體系進(jìn)行CSP分型，共分為11個(gè)基因型，較多為t04A， t03和t01，其中1個(gè)為新型。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的基因型菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的深入研究發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、最適生長(zhǎng)溫度與其他菌株并無顯著差別。同時(shí)發(fā)現(xiàn)福建有12株t10型，另外僅上海和北京各發(fā)現(xiàn)一株t10型。7種不同基因型煙曲霉對(duì)伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而我國(guó)南方地區(qū)與北方地區(qū)臨床分離到的煙曲霉對(duì)伊曲康唑的敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：我國(guó)不同地域致病煙曲霉的基因型存在地域差異，t10型主要在南方氣候較暖地區(qū)居多，提示了t10型可能在亞熱帶地區(qū)常見。不同基因型的煙曲霉對(duì)抗真菌藥物的敏感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，，但我國(guó)南方地區(qū)與北方地區(qū)臨床分離到的煙曲霉對(duì)伊曲康唑的敏感性存在差異。
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【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R379

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2374063