【摘要】：miR-23a～27a～24-2基因簇是位于基因間的一個microRNA簇,擁有其獨立的啟動子,能夠轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)生3種成熟的microRNA:miR-23a, miR-24-2和miR-27a。 LPS、CpG ODN和poly I:C都能激活腹腔巨噬細胞中的NF-κB信號通路,同時也能夠抑制細胞中miR-23a-24-27a基因簇的轉(zhuǎn)錄或其成熟體miR-23a, miR-24-2和miR-27a的表達,提示miR-23a, miR24-27a基因簇很可能與NF-κB之間存在著相關(guān)性。RAW264.7中過表達miR-23a, miR-24-2或miR-27a后,可促進促炎細胞因子IL-1β, TNF-α和IL-6的表達,表明miR-23a-24-27a基因簇很可能通過其3種成熟體協(xié)同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮對炎癥的調(diào)控作用。 NF-κB信號通路的活化,能夠促進p65和STAT3向細胞核的轉(zhuǎn)移,從而促進p65和STAT3對其下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本項研究采用生物信息軟件,對miR-23a-27a-24-2基因簇啟動子上可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)有與NF-κB信號通路相關(guān)的p65和STATx結(jié)合位點。將miR-23a～27a～24-2基因簇啟動子構(gòu)建到pGL3-basic熒光素酶報告載體后,與p65siRNA或STAT3siRNA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,通過雙熒光報告系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)抑制p65后,熒光素酶表達降低,而抑制STAT3后,熒光素酶表達顯著增加,提示炎癥反應(yīng)活化的p65與STAT3與miR-23a-27a-24-2基因簇啟動子間存在著密切的調(diào)控關(guān)系。 無論是經(jīng)LPS刺激不同時間的RAW264.7細胞或者是經(jīng)體內(nèi)注射LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞,miR-23a的表達均下降,提示LPS在體內(nèi)外都能夠抑制miR-23a的表達。將小鼠腹腔巨噬細胞轉(zhuǎn)染miR-23a mimics,從而過表達miR-23a后,在LPS刺激條件下,促炎細胞因子IL-6和TNF-a的表達明顯高于對照組,IL-1β的表達變化不顯著；而當細胞轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor,從而抑制內(nèi)源性miR-23a的表達時,在LPS刺激條件下,IL-6和IL-1β的表達則明顯下調(diào),TNF-α的表達變化不顯著。由此可以看出,miR-23a與促炎細胞因子的表達之間存在協(xié)同性。 由于microRNA通過其對基因的靶向抑制作用而發(fā)揮其生物學功能,因此推測miR-23a很可能通過靶向NF-κB信號通路抑制基因發(fā)揮作用。為了驗證這一假說,構(gòu)建了攜帶NF-κB啟動子區(qū)(NFκBαSR)和熒光素酶報告基因的表達質(zhì)粒(pGL3-p65promoter),與miR-23a共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,通過雙熒光系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達水平,發(fā)現(xiàn)NF-κB驅(qū)動的熒光酶表達上調(diào),進一步證明miR-23a能促進p65的表達,即激活NF-κB的信號通路。進一步采用targetscan等生物信息軟件分析,發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路抑制基因A203'UTR具有miR-23a潛在的結(jié)合位點。將其3'UTR及其突變體構(gòu)建到pMIR-report載體后,與miR-23a共轉(zhuǎn)染,檢測熒光酶活性,發(fā)現(xiàn)A203'UTR使熒光酶活性下調(diào)了近2倍,而突變體對照基本沒變化；Western blot進一步證實了miR-23a對A20的靶向抑制作用。 已有許多文獻報告,LPS刺激巨噬細胞,能夠促進A20等抑炎基因的表達,從而形成NF-κB信號通路的負反饋調(diào)節(jié)通路。因此,miR-23a很可能通過對A20的抑制作用,實現(xiàn)對NF-κB信號通路激活的調(diào)控作用,促進IL-6等促炎細胞因子的表達,防止NF-κB信號通路的過度活化。本項研究在microRNA的水平上進一步解釋了NF-κB信號通路負反饋調(diào)節(jié)機理,為自身免疫疾病以及炎癥的防治療提供了新的思路。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊一新;李桂源;;LPS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進展[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2006年01期

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本文編號：2371558