【摘要】：miR-23a～27a～24-2基因簇是位于基因間的一個(gè)microRNA簇,擁有其獨(dú)立的啟動(dòng)子,能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生3種成熟的microRNA:miR-23a, miR-24-2和miR-27a。 LPS、CpG ODN和poly I:C都能激活腹腔巨噬細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路,同時(shí)也能夠抑制細(xì)胞中miR-23a-24-27a基因簇的轉(zhuǎn)錄或其成熟體miR-23a, miR-24-2和miR-27a的表達(dá),提示miR-23a, miR24-27a基因簇很可能與NF-κB之間存在著相關(guān)性。RAW264.7中過(guò)表達(dá)miR-23a, miR-24-2或miR-27a后,可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β, TNF-α和IL-6的表達(dá),表明miR-23a-24-27a基因簇很可能通過(guò)其3種成熟體協(xié)同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮對(duì)炎癥的調(diào)控作用。 NF-κB信號(hào)通路的活化,能夠促進(jìn)p65和STAT3向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)p65和STAT3對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本項(xiàng)研究采用生物信息軟件,對(duì)miR-23a-27a-24-2基因簇啟動(dòng)子上可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)有與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的p65和STATx結(jié)合位點(diǎn)。將miR-23a～27a～24-2基因簇啟動(dòng)子構(gòu)建到pGL3-basic熒光素酶報(bào)告載體后,與p65siRNA或STAT3siRNA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)抑制p65后,熒光素酶表達(dá)降低,而抑制STAT3后,熒光素酶表達(dá)顯著增加,提示炎癥反應(yīng)活化的p65與STAT3與miR-23a-27a-24-2基因簇啟動(dòng)子間存在著密切的調(diào)控關(guān)系。 無(wú)論是經(jīng)LPS刺激不同時(shí)間的RAW264.7細(xì)胞或者是經(jīng)體內(nèi)注射LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,miR-23a的表達(dá)均下降,提示LPS在體內(nèi)外都能夠抑制miR-23a的表達(dá)。將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-23a mimics,從而過(guò)表達(dá)miR-23a后,在LPS刺激條件下,促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-a的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,IL-1β的表達(dá)變化不顯著；而當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor,從而抑制內(nèi)源性miR-23a的表達(dá)時(shí),在LPS刺激條件下,IL-6和IL-1β的表達(dá)則明顯下調(diào),TNF-α的表達(dá)變化不顯著。由此可以看出,miR-23a與促炎細(xì)胞因子的表達(dá)之間存在協(xié)同性。 由于microRNA通過(guò)其對(duì)基因的靶向抑制作用而發(fā)揮其生物學(xué)功能,因此推測(cè)miR-23a很可能通過(guò)靶向NF-κB信號(hào)通路抑制基因發(fā)揮作用。為了驗(yàn)證這一假說(shuō),構(gòu)建了攜帶NF-κB啟動(dòng)子區(qū)(NFκBαSR)和熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒(pGL3-p65promoter),與miR-23a共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,通過(guò)雙熒光系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)NF-κB驅(qū)動(dòng)的熒光酶表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步證明miR-23a能促進(jìn)p65的表達(dá),即激活NF-κB的信號(hào)通路。進(jìn)一步采用targetscan等生物信息軟件分析,發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路抑制基因A203'UTR具有miR-23a潛在的結(jié)合位點(diǎn)。將其3'UTR及其突變體構(gòu)建到pMIR-report載體后,與miR-23a共轉(zhuǎn)染,檢測(cè)熒光酶活性,發(fā)現(xiàn)A203'UTR使熒光酶活性下調(diào)了近2倍,而突變體對(duì)照基本沒(méi)變化；Western blot進(jìn)一步證實(shí)了miR-23a對(duì)A20的靶向抑制作用。 已有許多文獻(xiàn)報(bào)告,LPS刺激巨噬細(xì)胞,能夠促進(jìn)A20等抑炎基因的表達(dá),從而形成NF-κB信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。因此,miR-23a很可能通過(guò)對(duì)A20的抑制作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)NF-κB信號(hào)通路激活的調(diào)控作用,促進(jìn)IL-6等促炎細(xì)胞因子的表達(dá),防止NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度活化。本項(xiàng)研究在microRNA的水平上進(jìn)一步解釋了NF-κB信號(hào)通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)理,為自身免疫疾病以及炎癥的防治療提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊一新;李桂源;;LPS所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年01期

，

本文編號(hào)：2371558