【摘要】： 目的:心腦血管疾病已成為威脅人類生命的重要疾病之一。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的增生和遷移,是許多心腦血管疾病發(fā)生的重要因素之一。Rho/Rho激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了眾多血管生理功能的調(diào)節(jié),如細(xì)胞骨架重組,平滑肌收縮,細(xì)胞增生、黏附、遷移以及其他炎癥反應(yīng)過程,而這些細(xì)胞功能又與許多血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。 ROCK即Rho激酶,廣泛存在于各種組織中,有兩種同源異構(gòu)體ROCK-Ⅰ,ROCK-Ⅱ。Rho激酶在多種組織器官的平滑肌收縮中起作用[2]。Rho激酶被Rho蛋白激活后,對(duì)下游肌球蛋白進(jìn)行磷酸化,使胞漿中的肌球蛋白輕鏈磷酸化水平增加,進(jìn)一步使肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白交聯(lián)增加,從而使肌動(dòng)蛋白微絲骨架聚合,引起肌動(dòng)-肌球蛋白收縮,最終引起VSMC遷移。闡明Rho激酶與血管平滑肌細(xì)胞的遷移的分子機(jī)制,將為許多心腦血管疾病的研究和治療提供重要的理論依據(jù)[3,4]。 本研究擬采用RNA干擾技術(shù),對(duì)ROCK-Ⅰ基因表達(dá)進(jìn)行下調(diào),研究ROCK-Ⅰ基因與血管平滑肌細(xì)胞遷移的關(guān)系。為進(jìn)一步研究Rho激酶與血管平滑肌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:根據(jù)大鼠ROCK-Ⅰ基因參考序列設(shè)計(jì)合成siRNA,通過實(shí)驗(yàn)篩選出有效的siRNA,然后通過脂質(zhì)體將ROCK-Ⅰ的siRNA轉(zhuǎn)入A7r5細(xì)胞,對(duì)于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1.提取細(xì)胞的總RNA,然后做逆轉(zhuǎn)錄PCR,在基因水平上檢測(cè)ROCK-Ⅰ基因表達(dá)下調(diào)的情況;2.提取細(xì)胞總蛋白,通過蛋白印跡技術(shù),在蛋白水平上檢測(cè)ROCK-Ⅰ基因表達(dá)下調(diào)情況;3.用Boyden微孔膜雙槽法進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),測(cè)定ROCK-Ⅰ基因表達(dá)下調(diào)前后細(xì)胞遷移率的影響。 結(jié)果: 1. siRNA轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn) 運(yùn)用帶有熒光標(biāo)記的siRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞(5h、24h、48h、72h),在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析。每組時(shí)間段做4個(gè)平行孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染效率分別為77.8%、85.2%、83.3%和85.7%。siRNA 5h即可被成功地轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,以48或72小時(shí)的轉(zhuǎn)染效果最佳。 2.脂質(zhì)體毒性實(shí)驗(yàn) 用不同濃度的脂質(zhì)體(分別為0、0.56ng/μl、0.83ng/μl、1.67ng/μl)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在不同的時(shí)間段(24h、48h、72h)收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算出不同濃度脂質(zhì)體在不同時(shí)間段的細(xì)胞死亡率,結(jié)合上述siRNA轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn),確定siRNA轉(zhuǎn)染效率最高時(shí)脂質(zhì)體的濃度和最佳的轉(zhuǎn)染時(shí)間。最終確定脂質(zhì)體最佳濃度為0.56ng/μl~0.83ng/μl。 3.在基因水平上的檢測(cè): 轉(zhuǎn)染48h和72h后,分別提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),在基因水平上檢測(cè)RNA干擾前后ROCK-Ⅰ表達(dá)量的變化。研究顯示siRNA轉(zhuǎn)染后ROCK-Ⅰ表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯下降(P=0.012)。 4.在蛋白水平上的檢測(cè)ROCK-Ⅰ表達(dá): 運(yùn)用免疫印跡技術(shù),檢測(cè)轉(zhuǎn)染72h后細(xì)胞中ROCK-Ⅰ表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中ROCK-Ⅰ蛋白的表達(dá)量比對(duì)照組明顯降低(P=0.022)。 5. PDGF-BB誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)遷移: 利用血小板源性生長(zhǎng)因子BB二聚體(PDGF-BB)作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞遷移,用Boyden微孔膜雙槽法檢測(cè)細(xì)胞遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PDGF-BB在低濃度時(shí),誘導(dǎo)劑與細(xì)胞遷移數(shù)量存在劑量依賴關(guān)系,隨著濃度的增加,細(xì)胞遷移的數(shù)量增加。當(dāng)PDGF-BB達(dá)到5ng/ml時(shí),隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加,細(xì)胞遷移的數(shù)量下降。因此,得出PDGF-BB的最佳誘導(dǎo)濃度為5ng/ml。 6. ROCK-Ⅰ基因表達(dá)下調(diào)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)遷移的影響: 用5ng/ml PDGF-BB誘導(dǎo)劑,以Boyden微孔膜雙槽法建立的細(xì)胞遷移的模型,觀察不同劑量的siRNA對(duì)平滑肌細(xì)胞(A7r5)遷移的影響。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別設(shè)置6個(gè)平行孔。顯微鏡下觀察到細(xì)胞遷移數(shù)量隨著siRNA劑量的增加而呈減少的趨勢(shì),表明ROCK-Ⅰ基因表達(dá)下調(diào)可以抑制血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)的遷移,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異(P=0.000)。 結(jié)論:通過RNA干擾方法成功地使ROCK-Ⅰ的基因表達(dá)下調(diào),證實(shí)ROCK-Ⅰ基因表達(dá)的下調(diào)可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移。這些研究為進(jìn)一步探討ROCK-Ⅰ與血管平滑肌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2371950