【摘要】： 目前,胚胎干細(xì)胞的研究主要集中在分離純化、擴(kuò)增技術(shù)和定向誘導(dǎo)分化幾個方面。本研究以胚胎干細(xì)胞作為研究對象,研究內(nèi)容共分以下兩部分: 第一部分主要是豬胚胎生殖細(xì)胞(EG)的分離培養(yǎng)研究。本實驗室采用STO細(xì)胞作飼養(yǎng)層,在培養(yǎng)基中添加分化抑制因子的方法,已成功分離培養(yǎng)獲得豬的EG細(xì)胞。為進(jìn)一步探索豬EG細(xì)胞更為理想的培養(yǎng)體系,并獲得能夠穩(wěn)定傳代的EG細(xì)胞系,第一部分以三個實驗展開了對豬EG細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的進(jìn)一步研究。 實驗一研究了條件培養(yǎng)基對豬EG細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。在原代分離豬PGCs的過程中,可以同時分離獲得豬胎兒成纖維細(xì)胞(PEF)和胎兒心臟成纖維細(xì)胞(EHF);經(jīng)培養(yǎng)純化后,提取這兩種細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄;RT-PCR檢測結(jié)果表明,PEF和EHF中均表達(dá)豬的LIF基因。因此,分別收集兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基,用來培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞。分別使用兩種條件培養(yǎng)基或?qū)l件培養(yǎng)基與STO飼養(yǎng)層細(xì)胞聯(lián)合使用來分離培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基必須與飼養(yǎng)層細(xì)胞聯(lián)合使用,才能維持EG細(xì)胞的增殖未分化狀態(tài)。 實驗二研究了Knockout培養(yǎng)基對豬EG細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。本實驗共分三組,其中實驗組I為Knockout DMEM與Knockout SR組成的Knockout培養(yǎng)基,實驗組II為Knockout DMEM/F-12+15%FCS的低滲培養(yǎng)基,對照組為DMEM+15%FCS的普通培養(yǎng)基,三個實驗組中均添加了細(xì)胞生長因子。結(jié)果表明實驗組I與對照組都可以獲得能夠傳代的EG細(xì)胞,實驗組I培養(yǎng)效果好于對照組;而實驗組II不能維持EG細(xì)胞穩(wěn)定傳代。因此,Knockout DMEM與Knockout SR組成的Knockout培養(yǎng)基可以用于分離培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞。 實驗三將PGCs與同源胎兒成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)分離培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞。培養(yǎng)獲得的細(xì)胞經(jīng)AKP染色,SSEA-1免疫熒光染色,轉(zhuǎn)錄因子Oct-4免疫熒光表達(dá),核型分析,體外分化實驗及電鏡觀察等多種方法進(jìn)行鑒定,證明其具有胚胎干細(xì)胞的特征。因此,PGCs與同源胎兒成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的方法可以用于分離培養(yǎng)豬EG細(xì)胞。 第二部分以小鼠ES細(xì)胞作為研究對象,分三個實驗對不同誘導(dǎo)劑在胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)中的作用以及基因轉(zhuǎn)染方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為IPCs進(jìn)行了初步探討。實驗一研究了GLP-1在誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向IPCs分化中的作用。誘導(dǎo)一周后,經(jīng)DTZ染色鑒定,陽性細(xì)胞很少;誘導(dǎo)兩周后,提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),GLP-1可以使與胰腺發(fā)育相關(guān)的重要基因Pdx1的表達(dá)量上調(diào),但誘導(dǎo)兩周仍未能獲得大量IPCs。 實驗二研究了bFGF在誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向IPCs分化中的作用。誘導(dǎo)后提取細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR未能檢測到IPCs相關(guān)基因的表達(dá)。實驗結(jié)果表明,在本實驗條件下,向培養(yǎng)基中單一添加bFGF并不能有效地誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向IPCs分化。 實驗三采用基因轉(zhuǎn)染的方法將Pdx1基因與Isl1基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞誘導(dǎo)其分化。轉(zhuǎn)染24h后,通過RT-PCR的方法檢測到Pdx1基因與Isl1基因在小鼠ES細(xì)胞中過表達(dá),其中Pdx1表達(dá)量明顯上調(diào),但是仍未檢測到其它IPCs相關(guān)基因的表達(dá)。這一結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染時間不夠,轉(zhuǎn)染24h后過表達(dá)的基因未能誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞的分化。但是由于過表達(dá)效果明顯,如果添加其他誘導(dǎo)劑在培養(yǎng)基中,繼續(xù)傳代培養(yǎng),將會有比較好的誘導(dǎo)結(jié)果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2369827