【摘要】： 目的:預(yù)測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3(Eh14-3-3)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,克隆與鑒定溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3基因,并純化重組Eh14-3-3蛋白,分析純化產(chǎn)物的免疫學(xué)特性,制備抗重組Eh14-3-3蛋白血清,比較不同內(nèi)阿米巴屬蟲株14-3-3蛋白序列,探討14-3-3蛋白作為研究遺傳進(jìn)化標(biāo)記分子的可能性。 方法:利用生物信息學(xué)網(wǎng)站的各種在線工具和Vector NTI Suite軟件包對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3(Eh14-3-3)基因進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè),分別以溶組織內(nèi)阿米巴HM1∶IMSS株滋養(yǎng)體總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA鏈和基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)合成引物,PCR擴(kuò)增Eh14-3-3蛋白編碼基因序列,克隆入pET19b載體,并用雙酶切法和DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),用樹脂層析純化目的蛋白。SDS-PAGE鑒定,并用ELISA鑒定純化產(chǎn)物的免疫學(xué)特性,檢測(cè)病人和正常人血清對(duì)其的反應(yīng)性,繼而以之免疫小鼠制備抗血清。隨后分別擴(kuò)增各不同內(nèi)阿米巴蟲株滋養(yǎng)體的14-3-3蛋白編碼基因序列,并對(duì)它們進(jìn)行了比較分析。 結(jié)果:溶組織內(nèi)阿米巴具有三種Eh14-3-3蛋白編碼基因的異構(gòu)體,與GenBank收錄(編號(hào)分別為EHU13418,EHU13419,EHU13420)的Eh14-3-3蛋白編碼基因一致。重組Eh14-3-3蛋白,通過純化層析,30kD附近得到單一蛋白條帶。ELISA等實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化得到的Eh14-3-3蛋白與慢性反復(fù)發(fā)作者血清和阿米巴結(jié)腸炎病人血清有反應(yīng),與包囊攜帶者血清、急性阿米巴肝膿瘍患者血清和正常人血清無明顯反應(yīng)�？怪亟MEh14-3-3蛋白血清的與溶組織內(nèi)阿米巴粗抗原ELISA反應(yīng)的效價(jià)為1∶200,但隨后的細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)為陰性。不同內(nèi)阿米巴屬蟲株的14-3-3蛋白序列比較結(jié)果提示內(nèi)阿米巴屬14-3-3基因高度保守,生物信息學(xué)分析還提示該蛋白是研究物種進(jìn)化的理想分子。 結(jié)論:溶組織內(nèi)阿米巴含有三個(gè)14-3-3蛋白的異構(gòu)體,它們可能在溶組織內(nèi)阿米巴的成囊過程中發(fā)揮重要作用。14-3-3蛋白是研究物種進(jìn)化有用的靶分子。
[Abstract]:Objective: to predict the structure and function of endomoeba 14-3-3 (Eh14-3-3) protein, clone and identify the 14-3-3 gene, and purify the recombinant Eh14-3-3 protein. The immunological characteristics of the purified product were analyzed and the anti-recombinant Eh14-3-3 protein serum was prepared. The 14-3-3 protein sequences of different Entamoeba strains were compared and the possibility of 14-3-3 protein being used as a genetic and evolutionary marker was discussed. Methods: using various online tools of bioinformatics website and Vector NTI Suite software package to analyze and predict the function of Amiba 14-3-3 (Eh14-3-3) gene in tissues. Using the reverse transcription synthesis of cDNA strand and genomic DNA of total RNA of HM1:IMSS strain as templates, primers were designed to amplify the encoding gene sequence of Eh14-3-3 protein by PCR and cloned into pET19b vector. It was identified by double enzyme digestion and DNA sequencing. E. coli BL21 (DE3) was expressed. The target protein. SDS-PAGE was purified by resin chromatography, and the immunological properties of the purified product were identified by ELISA. Then the mice were immunized with it to prepare antiserum. The 14-3-3 protein coding gene sequences of trophozoites of different endoamoeba strains were amplified and compared with each other. Results: amoeba had three isoforms of Eh14-3-3 protein encoding genes, which were consistent with the Eh14-3-3 protein encoding genes included in GenBank (numbered EHU13418,EHU13419,EHU13420). The recombinant Eh14-3-3 protein was purified and a single protein band was obtained near 30kD by purification chromatography. ELISA and other experiments confirmed that the purified Eh14-3-3 protein reacted with the sera of patients with chronic recurrent episodes and the sera of patients with amoeba colitis. There was no significant response to the serum of patients with acute amoebic liver abscess and normal persons. The titer of anti-recombinant Eh14-3-3 protein serum was 1: 200 and the titer of ELISA was 1: 200, but the later cell localization test was negative. The comparison of 14-3-3 protein sequences among different strains of Entamoeba indicates that the 14-3-3 gene of Entamoeba is highly conserved, and the bioinformatics analysis also indicates that the 14-3-3 protein is an ideal molecule for studying the evolution of species. Conclusion: Entamoeba in tissue contains three isomers of 14-3-3 protein, which may play an important role in the formation of endomoeba cysts. 14-3-3 protein is a useful target molecule to study the evolution of species.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R383

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2369028