【摘要】： 目的:預測溶組織內阿米巴14-3-3(Eh14-3-3)蛋白的結構與功能,克隆與鑒定溶組織內阿米巴14-3-3基因,并純化重組Eh14-3-3蛋白,分析純化產物的免疫學特性,制備抗重組Eh14-3-3蛋白血清,比較不同內阿米巴屬蟲株14-3-3蛋白序列,探討14-3-3蛋白作為研究遺傳進化標記分子的可能性。 方法:利用生物信息學網站的各種在線工具和Vector NTI Suite軟件包對溶組織內阿米巴14-3-3(Eh14-3-3)基因進行分析和功能預測,分別以溶組織內阿米巴HM1∶IMSS株滋養(yǎng)體總RNA逆轉錄合成的cDNA鏈和基因組DNA為模板,設計合成引物,PCR擴增Eh14-3-3蛋白編碼基因序列,克隆入pET19b載體,并用雙酶切法和DNA測序進行鑒定。在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,用樹脂層析純化目的蛋白。SDS-PAGE鑒定,并用ELISA鑒定純化產物的免疫學特性,檢測病人和正常人血清對其的反應性,繼而以之免疫小鼠制備抗血清。隨后分別擴增各不同內阿米巴蟲株滋養(yǎng)體的14-3-3蛋白編碼基因序列,并對它們進行了比較分析。 結果:溶組織內阿米巴具有三種Eh14-3-3蛋白編碼基因的異構體,與GenBank收錄(編號分別為EHU13418,EHU13419,EHU13420)的Eh14-3-3蛋白編碼基因一致。重組Eh14-3-3蛋白,通過純化層析,30kD附近得到單一蛋白條帶。ELISA等實驗證實純化得到的Eh14-3-3蛋白與慢性反復發(fā)作者血清和阿米巴結腸炎病人血清有反應,與包囊攜帶者血清、急性阿米巴肝膿瘍患者血清和正常人血清無明顯反應。抗重組Eh14-3-3蛋白血清的與溶組織內阿米巴粗抗原ELISA反應的效價為1∶200,但隨后的細胞定位實驗為陰性。不同內阿米巴屬蟲株的14-3-3蛋白序列比較結果提示內阿米巴屬14-3-3基因高度保守,生物信息學分析還提示該蛋白是研究物種進化的理想分子。 結論:溶組織內阿米巴含有三個14-3-3蛋白的異構體,它們可能在溶組織內阿米巴的成囊過程中發(fā)揮重要作用。14-3-3蛋白是研究物種進化有用的靶分子。
[Abstract]:Objective: to predict the structure and function of endomoeba 14-3-3 (Eh14-3-3) protein, clone and identify the 14-3-3 gene, and purify the recombinant Eh14-3-3 protein. The immunological characteristics of the purified product were analyzed and the anti-recombinant Eh14-3-3 protein serum was prepared. The 14-3-3 protein sequences of different Entamoeba strains were compared and the possibility of 14-3-3 protein being used as a genetic and evolutionary marker was discussed. Methods: using various online tools of bioinformatics website and Vector NTI Suite software package to analyze and predict the function of Amiba 14-3-3 (Eh14-3-3) gene in tissues. Using the reverse transcription synthesis of cDNA strand and genomic DNA of total RNA of HM1:IMSS strain as templates, primers were designed to amplify the encoding gene sequence of Eh14-3-3 protein by PCR and cloned into pET19b vector. It was identified by double enzyme digestion and DNA sequencing. E. coli BL21 (DE3) was expressed. The target protein. SDS-PAGE was purified by resin chromatography, and the immunological properties of the purified product were identified by ELISA. Then the mice were immunized with it to prepare antiserum. The 14-3-3 protein coding gene sequences of trophozoites of different endoamoeba strains were amplified and compared with each other. Results: amoeba had three isoforms of Eh14-3-3 protein encoding genes, which were consistent with the Eh14-3-3 protein encoding genes included in GenBank (numbered EHU13418,EHU13419,EHU13420). The recombinant Eh14-3-3 protein was purified and a single protein band was obtained near 30kD by purification chromatography. ELISA and other experiments confirmed that the purified Eh14-3-3 protein reacted with the sera of patients with chronic recurrent episodes and the sera of patients with amoeba colitis. There was no significant response to the serum of patients with acute amoebic liver abscess and normal persons. The titer of anti-recombinant Eh14-3-3 protein serum was 1: 200 and the titer of ELISA was 1: 200, but the later cell localization test was negative. The comparison of 14-3-3 protein sequences among different strains of Entamoeba indicates that the 14-3-3 gene of Entamoeba is highly conserved, and the bioinformatics analysis also indicates that the 14-3-3 protein is an ideal molecule for studying the evolution of species. Conclusion: Entamoeba in tissue contains three isomers of 14-3-3 protein, which may play an important role in the formation of endomoeba cysts. 14-3-3 protein is a useful target molecule to study the evolution of species.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R383

【共引文獻】

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本文編號：2369028