【摘要】： 兒童急性呼吸道感染是世界范圍內(nèi)小兒最常見(jiàn)的致病和致死原因之一,目前統(tǒng)計(jì)共涉及有七大病毒科的200多種病毒,但人類對(duì)呼吸道病原的研究并未完善。在過(guò)去的幾十年里,由于高敏感性檢測(cè)方法的建立,使更多的呼吸道感染病毒病原被鑒定,冠狀病毒新亞型(SARS,HKU1,NL63)、人博卡病毒等即是近期利用新的方法被檢測(cè)到的新呼吸道感染病原,從而進(jìn)一步擴(kuò)展了急性呼吸道感染病毒病原譜。 人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)是2001年荷蘭學(xué)者Van den Hoogen等人從小兒下呼吸道感染樣本中分離到的一種新呼吸道病原。根據(jù)序列分析結(jié)果將其歸屬于副粘病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬,是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒�；蚪M全長(zhǎng)約13550nt,包括A、B兩個(gè)基因型,每種基因型又分為兩個(gè)基因亞型。hMPV與禽偏肺病毒APV-C有較高的同源性。由于我國(guó)幅員遼闊,病毒流行特征分布不一。為了解hMPV在我國(guó)湖南地區(qū)的流行情況,我們以住院兒童為研究對(duì)象,調(diào)查并分析了hMPV在湖南地區(qū)因呼吸道感染入院兒童中的流行情況,分析了hMPV膜蛋白序列的變異情況,結(jié)合中國(guó)北京地區(qū)和世界其它地區(qū)公布的相關(guān)資料進(jìn)行了比較分析;根據(jù)已有的參考文獻(xiàn)及序列分析,選擇以中國(guó)hMPV流行株(B基因型)為研究對(duì)象,初步研究了hMPV B基因型的膜蛋白F、M為基礎(chǔ)的疫苗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果。本文 主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果具體如下: 一.住院呼吸道感染患兒中人偏肺病毒的流行狀況 為了解我國(guó)湖南地區(qū)hMPV在兒童中的流行情況,探討其流行特征,2005年在湖南地區(qū)采集了232份呼吸道急性感染住院兒童鼻咽抽出物樣本(NPA)。經(jīng)核酸檢測(cè),其中17例(7.3%)為hMPV核酸陽(yáng)性,均為5歲以下患兒,男女比例為11:6。進(jìn)化分析顯示我國(guó)湖南地區(qū)四種hMPV亞型均有流行,包括A1、A2、B1、B2亞型,北京地區(qū)同期流行主要為A2、B2,世界其它地區(qū)常以一種基因型為主,且以A型為多。17例hMPV陽(yáng)性的病人主要臨床癥狀為發(fā)熱、流涕、喘息、氣促等典型的呼吸道感染癥狀。臨床診斷為肺炎(6例)、支氣管肺炎(5例)、支氣管炎(6例)。在17例hMPV陽(yáng)性病人中,與其他病毒混合感染有6例,其中RSV(5例)、HBoV(1例),混合感染率為35%。 二、人偏肺病毒膜表面蛋白基因序列特征分析 利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了我國(guó)hMPV G、F、M基因片段。將擴(kuò)增的膜蛋白全長(zhǎng)基因序列與NCBI已經(jīng)公布的(包括我國(guó)在北京地區(qū)分離的毒株)核酸序列比較分析發(fā)現(xiàn):hMPV膜蛋白G基因變異較大,核酸變異主要集中在胞外區(qū),基因型之間同源性僅有30～40%,且長(zhǎng)度變化大,種類多(711nt,675nt,660nt,696nt),這些在病毒基因變異分析中較少見(jiàn)。序列變化主要由下列原因引起:無(wú)義突變(TAA和TAG的引入),堿基插入、缺失、顛換等引起氨基酸閱讀框突變。hMPV膜蛋白F蛋白序列較保守,F蛋白是主要的病毒抗原,能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體�；蛐椭g氨基酸同源性達(dá)94%以上,能引起交叉反應(yīng),hMPV F蛋白具有與其它副粘病毒科成員相似的特點(diǎn)。因此,選擇在本文候選疫苗研究中的主要對(duì)象。此外,M蛋白序列最為保守,基因型之間氨基酸同源性達(dá)95%以上,在病毒檢測(cè)中常以M基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物。M蛋白在病毒包裝和出芽過(guò)程中起重要作用,能與膜蛋白及核衣殼蛋白相互作用,所以我們也同時(shí)選擇它作為本文候選疫苗的抗原。hMPV與人呼吸道合胞病毒的膜蛋白在蛋白特性上有某些共性,推測(cè)其在致病與免疫機(jī)制方面有相似之處。 根據(jù)序列分析及已有的文獻(xiàn)報(bào)道,借鑒其它病毒疫苗(AIDS、hRSV、HCoV等疫苗)的研制,確定hMPV疫苗研究的靶基因?yàn)镕△TM(F去除穿膜區(qū)),并引入基質(zhì)蛋白M進(jìn)行聯(lián)合免疫。設(shè)計(jì)構(gòu)建了嵌有膜蛋白基因F△TM、M的腺病毒載體疫苗及DNA疫苗,將不同形式的疫苗即DNA疫苗與腺病毒載體疫苗聯(lián)用進(jìn)行免疫,結(jié)果顯示疫苗聯(lián)用比單獨(dú)應(yīng)用一種疫苗可以提高體液免疫和細(xì)胞免疫水平:DNA疫苗初免一次,腺病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫兩次,產(chǎn)生的抗體滴度最高,細(xì)胞免疫效果也明顯。由于呼吸道病毒的侵入方式和途徑是以呼吸道上皮為首要部位,因此粘膜免疫在hMPV的預(yù)防中尤為重要。本文采用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的粘膜免疫組方(JY佐劑系統(tǒng))進(jìn)行鼻腔粘膜免疫。結(jié)果表明DNA疫苗肌注免疫一次,腺病毒載體疫苗鼻內(nèi)滴注加強(qiáng)免疫兩次,所產(chǎn)生的體液免疫抗體滴度和粘膜免疫sIgA抗體滴度最高,細(xì)胞免疫水平效果相當(dāng)。F△TM、M疫苗聯(lián)用的效果比單用F△TM疫苗效果好,可能是M、F△TM之間有相互作用從而導(dǎo)致疫苗抗原性增強(qiáng),提高了免疫效果,其作用機(jī)制需要進(jìn)一步探討。疫苗免疫反應(yīng)偏向于Th1免疫反應(yīng)類型。 綜上所述,本論文對(duì)湖南地區(qū)hMPV進(jìn)行基因分型及膜蛋白序列分析,選擇了候選疫苗株,確定了候選疫苗研究的靶抗原,構(gòu)建了DNA和非復(fù)制型腺病毒載體兩種疫苗,在動(dòng)物模型上進(jìn)行了,單獨(dú)免疫和聯(lián)合免疫;注射免疫和鼻腔粘膜免疫的系統(tǒng)的免疫效果評(píng)價(jià)。本文為進(jìn)一步探討我國(guó)hMPV的流行監(jiān)控及疫苗研制奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R373;R392

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本文編號(hào)：2358991