【摘要】： 背景 自抗體技術(shù)產(chǎn)生以來,通常以蛋白質(zhì)作為抗原免疫小鼠。這些用于免疫的蛋白質(zhì)通常從組織細(xì)胞中分離提純或通過基因工程表達(dá),其制備過程操作繁雜,且實(shí)驗(yàn)周期長;有些蛋白質(zhì)的構(gòu)象表位易發(fā)生改變,有些蛋白質(zhì)甚至無法獲得。用合成肽來取代蛋白質(zhì),價(jià)格昂貴、產(chǎn)量小。 此外SARS以及禽流感、手足口等突發(fā)傳染病不斷地警示我們:突發(fā)傳染性疾病隨時(shí)可能給人類帶來的災(zāi)難。這些突發(fā)傳染病原常常亞型眾多,加上基因突變、重組和重排,使其變異極快,早期血清學(xué)診斷無疑對預(yù)防、控制其傳播具有重要意義。血清學(xué)診斷的前提是獲得特異性抗體。制備抗體的傳統(tǒng)方法速度慢并且費(fèi)力。 利用基因免疫方法(genetic immunization)制備單抗的原理是將編碼目的蛋白的基因(代替常規(guī)的蛋白質(zhì)抗原)經(jīng)各種基因轉(zhuǎn)移途徑轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞,表達(dá)目的蛋白。目的蛋白在體內(nèi)作為抗原,激發(fā)免疫應(yīng)答,然后進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞融合。基因免疫制備單抗可以制備針對天然表位的抗體,而且節(jié)省制備單抗時(shí)間2-3個(gè)月,是一種很有前途的抗體制備方法。 目前常用的基因免疫方法,轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平由于這種局部注射而相當(dāng)?shù)筒⑶覂H局限在注射部位。通過傳統(tǒng)方法靜脈注射質(zhì)粒DNA,雖然可以使DNA分布在很多器官,但是質(zhì)粒DNA進(jìn)入體內(nèi)后,迅速被血液及組織表面的核酸酶降解并且很快從血液循環(huán)中清除。 為了克服這些問題,1999年Liu及Zhang等經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射(3-8 s內(nèi)完成)大體積質(zhì)粒DNA溶液(占小鼠體重的8%-12%),發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)小鼠多種組織中即有目的基因的表達(dá),其中在肝臟組織中表達(dá)水平最高,這種方法被稱為水流動力學(xué)注射(hydrodynamics-based procudure)。應(yīng)用此方法大大提高了質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率,從而升高了蛋白的表達(dá)。 水流動力學(xué)出現(xiàn)以來,在基因治療方面被得到廣泛的應(yīng)用,但是在基因免疫制備抗體方面卻未有報(bào)道。 死亡受體5(death receptor,DR5)是腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的主要受體之一,TRAIL可引起許多腫瘤細(xì)胞系的凋亡,對絕大多數(shù)正常細(xì)胞不具有凋亡效應(yīng),被認(rèn)為是癌癥治療的潛在的生物制劑。DR5與TRAIL結(jié)合后可以通過其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域傳遞凋亡信號,從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生,是激活凋亡途徑的很好的靶標(biāo)。 目的 通過水流動力學(xué)方法提高基因轉(zhuǎn)移的效率,從而制備高效價(jià)的血清,并提高基因免疫制備單抗的效率,為制備抗體提供一條新的路徑。 方法 將DR5基因克隆pcDNA3.0載體中,測序鑒定正確。分別通過水流動力學(xué)注射法和常規(guī)肌肉注射方法免疫小鼠,通過免疫組化和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物,ELISA測定抗體的效價(jià)。 通過雜交瘤技術(shù)篩選抗DR5單克隆抗體。通過非競爭ELISA方法分析了單抗的親和常數(shù),通過ELISA方法分析了單抗的亞型,流式細(xì)胞術(shù)檢測單抗與Jurkat細(xì)胞表面的DR5結(jié)合。 結(jié)果 構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.0/DR5。通過水流動力學(xué)方法和肌肉注射兩種方法免疫小鼠,間接ELISA結(jié)果顯示末次免疫后水流動力學(xué)免疫組抗體滴度最高可達(dá)到為1:102 400,肌肉注射免疫組抗體滴度最高為1:25 600:Western blot結(jié)果顯示小鼠抗DR5多克隆抗體識別識別Jurkat細(xì)胞的DR5蛋白條帶。免疫組化結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的DR5蛋白主要表達(dá)在食管癌細(xì)胞核膜周圍,與預(yù)期相符。 通過細(xì)胞融合技術(shù)成功制備了一株抗DR5單克隆抗體A9。經(jīng)分析其亞型為IgM,非競爭ELISA結(jié)果顯示A9的親合常數(shù)為1.64×10~9L/mol。流式細(xì)胞儀檢測顯示A9可以與Jurkat細(xì)胞表面的DR5特異性結(jié)合。 結(jié)論 本課題以DR5為例,建立了利用水流動力學(xué)進(jìn)行基因免疫,制備抗體的新方法。該方法與常規(guī)的蛋白免疫方法相比,具有節(jié)省制備單抗時(shí)間,可以制備針對天然表位的抗體的優(yōu)點(diǎn);與肌肉免疫進(jìn)行基因免疫方法相比,可以產(chǎn)生更高效價(jià)的血清,在western-blot試驗(yàn)中獲得更好的效果,更加容易制備單克隆抗體。
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【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2359049