【摘要】： 丙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。丙型肝炎病毒感染是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的主要原因之一,全球大約有1.7億人感染HCV。目前尚無有效的防治方法,IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療是臨床上標(biāo)準(zhǔn)的治療方法,但只對不到50%的患者有效。 HCV是一單股正鏈RNA病毒,病毒基因組全長9600bp,含有一個大的開放讀碼框(open reading region,ORF)。它編碼一個多聚蛋白前體,經(jīng)宿主信號肽酶和病毒基因編碼的蛋白酶切割產(chǎn)生4個結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白、包膜蛋白E1、E2和P7)和6個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。核心蛋白是HCV編碼的一個重要結(jié)構(gòu)蛋白,位于整個多聚蛋白的N-末端,是病毒核衣殼的組成部分,在不同型的HCV中具有高度的保守性。越來越多的研究結(jié)果表明核心蛋白與HCV感染所致肝細胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。但由于HCV具有極強的宿主特異性,目前對HCV及核心蛋白的機制和功能的研究多在細胞模型,缺乏合適的小動物模型阻礙了在動物整體水平上的研究。 我國HCV流行株主要為基因1b型,且感染1b型HCV患者運用IFN治療效果較差,與肝硬化及肝癌的關(guān)系較為密切。因此研究1b型HCV核心蛋白在HCV持續(xù)感染及肝癌發(fā)病機制中的作用,對防治我國丙型肝炎具有重要的實際意義。因此本課題基于成年小鼠,聯(lián)合水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)與噬菌體整合酶系統(tǒng),建立1b型HCV核心蛋白長期穩(wěn)定表達小鼠模型,作為經(jīng)典轉(zhuǎn)基因技術(shù)的補充,并初步將其用于HCV核心蛋白抑制劑-shRNAs在體內(nèi)抗HCV的作用效果的評價。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下: 1.構(gòu)建HCV核心蛋白表達載體pGL3-attB-Core-Fluc。該載體含有核心蛋白基因、報告基因Fluc和?C31整合酶識別位點attB。將pGL3-attB-Core-Fluc與對照載體pGL3-attB-Core、pGL3-attB-Fluc轉(zhuǎn)染Huh7細胞,pGL3-attB-Core-Fluc核心蛋白表達量與pGL3-attB-Core核心蛋白表達量是一致的,而pGL3-attB-Core-Fluc的Fluc活性卻低于pGL3-attB-Fluc。在C57BL/6小鼠體內(nèi)也證實了上述結(jié)果。 2.利用?C31整合酶介導(dǎo)位點特異性整合的特點,建立HCV核心蛋白穩(wěn)定表達小鼠模型。通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將核心蛋白表達載體pGL3-attB-Core-Fluc與編碼?C31整合酶的表達載體pCMV-int共轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)。實驗證實,在?C31整合酶作用下,HCV核心蛋白及報告基因Fluc整合到小鼠肝臟第2號染色體的mpsL1位點,在小鼠肝臟獲得穩(wěn)定表達,長達420d。 3.在上述動物模型基礎(chǔ)上,對靶向HCV核心蛋白不同位點的shRNAs進行了體內(nèi)作用效果的評價。本實驗在pSilencerTM2.1-U6 neo載體基礎(chǔ)上,構(gòu)建發(fā)夾型siRNA-shRNA452、shRNA479、shRNA523表達質(zhì)粒。結(jié)果顯示:在細胞水平, shRNA-452、shRNA-479和shRNA-523對核心蛋白和報告基因Fluc均有抑制作用,抑制率可達到40-55%;在核心蛋白瞬時表達小鼠模型中, shRNA-Fluc和shRNA-523的抑制作用在轉(zhuǎn)染后24 hr已被檢測到,并且隨時間的延長抑制作用更加明顯。而shRNA-452在轉(zhuǎn)染后48 hr還未出現(xiàn)抑制作用;在核心蛋白穩(wěn)定表達小鼠模型中,在第6hr、12hr,shRNA523抑制Fluc的活性分別達到了76.4±26.0%和91.8±8.0%,一次注射該抑制作用持續(xù)24hr。 總之,本研究將水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)及噬菌體整合酶系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用,建立了HCV核心蛋白長期穩(wěn)定表達小鼠模型。利用該模型可以在小鼠體內(nèi)實時監(jiān)測靶向HCV核心蛋白shRNA的作用。這種新穎而簡單的方法可用于評價抗HCV核酸藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 帥麗芳;唐博恒;張若霜;趙勇;楊國柱;陳系古;;嚴(yán)密型四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控的表達HCV-C基因雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年09期

2 李華,陳規(guī)劃,潘承恩,王全穎,楊廣笑;一種肝臟持續(xù)表達丙型肝炎病毒核心蛋白的小動物模型[J];中華實驗外科雜志;2003年03期

3 單于,陳系古,黃冰,胡安斌,郭中敏,趙寧;表達丙肝病毒核心蛋白基因的人肝細胞模型的建立[J];中華實驗外科雜志;2003年11期

4 詹林盛,饒林,彭劍淳,王會中,賈帥爭,王全立;HCVIRES介導(dǎo)熒光素酶小鼠體內(nèi)表達模型的建立[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年03期

5 楊國柱;傅思瑩;黃冰;單于;肖東;馬蕓;鄧新燕;陳系古;;肝臟特異性可調(diào)控丙型肝炎病毒核心蛋白表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J];中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2007年04期

6 全俊 ,胡國齡 ,范學(xué)工 ,劉雙虎 ,譚德明;丙型肝炎病毒核心區(qū)蛋白在HepG2細胞中的表達[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2002年20期

，

本文編號：2348200