【摘要】： 心臟間隙連接通道是心肌細(xì)胞之間的特殊連接通道,其功能是完成心肌細(xì)胞之間的電化學(xué)信息交換,其功能的異常與心律失常的發(fā)生有密切關(guān)系。心室間隙連接通道主要由連接蛋白43組成。間隙連接通道的功能主要受胞內(nèi)pH值、胞內(nèi)Ca2+濃度、連接蛋白磷酸化狀態(tài)、跨通道電壓的調(diào)控。新近的一些研究表明高血糖可以促間隙連接通道連接蛋白43磷酸化并使其功能發(fā)生改變。但高血糖促連接蛋白43磷酸化的具體位點(diǎn)及其機(jī)理尚不清楚。高血糖可以激活蛋白激酶C,而蛋白激酶C又可以使連接蛋白43羧基末端絲氨酸磷酸化,據(jù)此推測(cè)高血糖可能通過(guò)使連接蛋白43羧基末端絲氨酸磷酸化而改變其調(diào)控功能。由此,本課題組擬應(yīng)用基因點(diǎn)突變、抗原再現(xiàn)技術(shù)來(lái)研究高血糖對(duì)間隙連接通道連接蛋白43的促磷酸化作用及其機(jī)制,如果能闡明高血糖致心臟間隙連接通道功能異常的機(jī)制,那將有助于闡明糖尿病患者心律失常的發(fā)生機(jī)理并為預(yù)防及治療糖尿病并發(fā)心律失常開(kāi)辟另一嶄新的方向。 本研究首先通過(guò)構(gòu)建pcDNA3-野生型連接蛋白43質(zhì)粒(Wt-Cx43-pcDNA3)、pcDNA3-突變型連接蛋白43質(zhì)粒(S262F-Cx43-pcDNA3,S368A -Cx43-pcDNA3),分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后得到表達(dá)相應(yīng)連接蛋白43的細(xì)胞株(Wt-Cx43-HeLa細(xì)胞,S262F-Cx43-HeLa細(xì)胞,S368A -Cx43-HeLa細(xì)胞)。應(yīng)用上述細(xì)胞株分兩部分進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。第一部分是在篩選后細(xì)胞株的培養(yǎng)基中加入不同濃度的葡萄糖(5mmol/L,25mmol/L),應(yīng)用抗磷酸化Cx43特異性抗體或應(yīng)用Cx43位點(diǎn)磷酸化抗體通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué),細(xì)胞免疫熒光,及免疫印跡分析Cx43磷酸化情況。對(duì)比分析不同葡萄糖濃度對(duì)Cx43磷酸化的影響及磷酸化位點(diǎn)。第二部分通過(guò)應(yīng)用Lucifer Yellow劃痕試驗(yàn)檢測(cè)高血糖間隙連接通道功能的改變。 結(jié)果表明:1,高血糖能促使Cx43磷酸化;2,應(yīng)用抗連接蛋白43磷酸化特異性位點(diǎn)的抗體(p-connexin43-Ser368和p-connexin43-Ser262)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,Western bloting,結(jié)果表明高血糖促使連接蛋白43的Ser368位點(diǎn)磷酸化,而對(duì)Ser262的無(wú)磷酸化作用;3,應(yīng)用Lucifer Yellow劃痕試驗(yàn)檢測(cè)間隙連接通道功能的改變,結(jié)果表明高血糖能降低間隙連接通道傳導(dǎo)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究表明(1)高血糖可以促進(jìn)Cx43的磷酸化,提高Cx43的磷酸化程度;(2)高血糖促使連接蛋白43的Ser368位點(diǎn)磷酸化;(3)高血糖能降低間隙連接通道傳導(dǎo),降低細(xì)胞GJ功能。
[Abstract]:The gap junction channel is a special junction channel between cardiomyocytes, whose function is to complete the electrochemical information exchange between cardiomyocytes. The abnormal function is closely related to the occurrence of arrhythmia. The ventricular gap junction channel is mainly composed of connexin 43. The function of gap junction channel is mainly regulated by intracellular pH, intracellular Ca2 concentration, phosphorylation of connexin, and transchannel voltage. Recent studies have shown that hyperglycemia stimulates gap junction channel junction protein 43 phosphorylation and changes its function. However, the specific site and mechanism of hyperglycemic connexin 43 phosphorylation are unclear. Hyperglycemia can activate protein kinase C, and protein kinase C can phosphorylate connectin 43 carboxyl terminal serine, which suggests that hyperglycemia may change its regulatory function by phosphorylation of connectin 43 carboxyl terminal serine. Therefore, our team intends to use gene point mutation and antigen reproduction technique to study the phosphorylation of gap junction protein 43 by hyperglycemia and its mechanism, if we can clarify the mechanism of hyperglycemia induced cardiac gap junction pathway dysfunction. It will help to clarify the mechanism of arrhythmia in patients with diabetes and open up a new direction for the prevention and treatment of arrhythmia. In this study, pcDNA3- wild-type connexin 43 plasmid (Wt-Cx43-pcDNA3) and pcDNA3- mutant connexin 43 plasmid (S262F-Cx43-pcDNA3S368A-Cx43-pcDNA3) were constructed and transfected into HeLa cells. After G418 screening, the cell lines expressing the corresponding connexin 43 (Wt-Cx43-HeLa cells, S262F-Cx43-HeLa cells, S368A-Cx43-HeLa cells) were obtained. The above cell lines were divided into two parts to carry out cytological experiments. The first part is to add different concentrations of glucose (5 mmol / L ~ 25 mmol 路L ~ (-1) to the culture medium of the screened cell line, and then apply anti-phosphorylated Cx43 specific antibody or Cx43 site phosphorylated antibody through cellular immunocytochemistry to make cell immunofluorescence. The phosphorylation of Cx43 was analyzed by Western blot. The effects of glucose concentration on Cx43 phosphorylation and phosphorylation sites were analyzed. In the second part, Lucifer Yellow scratch test was used to detect the change of gap junction channel function. The results showed that: 1) hyperglycemia could promote the phosphorylation of Cx43; 2. The results of cellular immunofluorescence, Western bloting, showed that hyperglycemia induced the phosphorylation of Ser368 site of connexin 43 by using antibodies (p-connexin43-Ser368 and p-connexin43-Ser262) to the phosphorylated site of connexin 43. No phosphorylation of Ser262 was observed. 3. Lucifer Yellow scratch test was used to detect the change of gap junction channel function. The results showed that hyperglycemia could reduce gap junction channel conduction. To sum up, the present study shows that (1) hyperglycemia can promote the phosphorylation of Cx43 and increase the phosphorylation of Cx43, (2) hyperglycemia can promote the phosphorylation of Ser368 site of connexin 43; (3) hyperglycemia can decrease gap junction channel conduction and GJ function.
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 杜蕓,王小玲,王永軍,吳國(guó)祥,楊會(huì)釵,左連富;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定COX-2,iNOS基因蛋白在食管癌上的表達(dá)及其與Bcl-2,PCNA的相關(guān)性[J];癌變.畸變.突變;2005年04期

2 王軍;黃啟福;;生姜抗腦缺血的藥理研究[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2006年04期

3 張銀萍;劉蕊;;細(xì)胞間黏附分子-1、白細(xì)胞介素-1介導(dǎo)缺血性中風(fēng)及中醫(yī)藥對(duì)其影響的研究現(xiàn)狀[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2009年02期

4 陳斌;周幫會(huì);韓旭東;邵賓;黃會(huì)嶺;姜國(guó)均;;胎衣不下奶牛胎盤(pán)中TNF-α和IL-10含量變化的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年04期

5 趙蜀軍,蔡圣榮,方志斌,劉涌,王元?jiǎng)?慢性支氣管炎肺氣虛證大鼠血清IL-8、MDA、SOD變化特征[J];安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年02期

6 陳軍;宣永華;劉光艷;衛(wèi)麗霞;;ki-67和Fas-L在鼻息肉上皮細(xì)胞中的表達(dá)[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年04期

7 馬曉凱;范凱;王濱;;一氧化氮與帕金森病[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年01期

8 王健;楊忠亮;朱耀環(huán);;慢胃靈合劑對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎治療的實(shí)驗(yàn)研究[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年03期

9 潘光棟,程南生,熊先澤,劉江文,李勝富,張國(guó)福,嚴(yán)律南;人膽囊上皮細(xì)胞優(yōu)化培養(yǎng)及其炎癥模型建立[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年15期

10 王海英;曾洪波;靳瓊瑤;孫小琳;朱昭瓊;;兩種膠體用于治療失血性休克犬對(duì)紅細(xì)胞免疫功能影響的對(duì)比研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年17期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 柳佳;陳佩東;單明秋;張麗;丁安偉;;蒲黃炮制前后對(duì)血瘀出血大鼠SOD、MDA及NO、TNOS水平的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì)2011年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2011年

2 王海英;曾洪波;靳瓊瑤;孫小琳;付豹;朱昭瓊;;兩種膠體用于治療失血性休克犬對(duì)紅細(xì)胞免疫功能影響的對(duì)比研究[A];2007年貴州省醫(yī)學(xué)會(huì)麻醉學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

3 楊思進(jìn);白雪;劉奇;羅鋼;;心安顆粒預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注心律失常和心肌Ca~(2+)的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)心病分會(huì)第十次全國(guó)中醫(yī)心病學(xué)術(shù)年會(huì)暨吉林省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)心病第二次學(xué)術(shù)會(huì)議論文精選[C];2008年

4 羅俊永;崔慧斐;;低分子肝素抗炎作用及機(jī)制研究進(jìn)展[A];中國(guó)藥學(xué)會(huì)全國(guó)多糖類(lèi)藥物研究與應(yīng)用研討會(huì)論文集[C];2008年

5 陳為歌;李壽斌;;TNF-α與神經(jīng)根炎癥研究進(jìn)展[A];泛中醫(yī)論壇·思考中醫(yī)2006——經(jīng)典中醫(yī)的特色和優(yōu)勢(shì)論文集[C];2006年

6 曹明芳;劉安;金威爾;;VEGF、bFGF、PEDF在視瞻昏渺發(fā)病機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究中的表達(dá)[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第七次眼科學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2008年

7 劉奇;白雪;楊思進(jìn);羅鋼;宋志宙;;心安顆粒預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注心律失常和心肌Ca~(2+)的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)心病分會(huì)第十一屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文精選[C];2009年

8 邱詠園;唐映紅;王蓓;曾嶸;鄧常清;黃小平;;黃芪和三七四種有效成分配伍對(duì)小鼠腦缺血再灌注早期抗氧化應(yīng)激物質(zhì)活性的影響[A];第九次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)理論研究學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 樊芳;羅格列酮抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人Tenon's囊成纖維細(xì)胞活化及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2011年

2 黎蕾;Visudyne光動(dòng)力療法預(yù)防晶狀體后囊膜混濁的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

3 王雪慧;通腑湯對(duì)急性肺損傷大鼠相關(guān)炎性因子及核轉(zhuǎn)錄因子κB的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 李美平;頭針對(duì)缺血再灌注致心律失常大鼠的影響及其機(jī)理研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2011年

5 歐陽(yáng)強(qiáng)波;針灸治療肥胖病臨床回顧性研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

6 于林;頸椎舒顆粒對(duì)大鼠退變頸椎間盤(pán)中AQP1、3及VEGF的影響研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

7 馬春全;益生菌制劑的研制及其對(duì)雛雞免疫學(xué)影響和機(jī)理的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

8 石文靜;吸氧和血管生長(zhǎng)因子在新生小鼠視網(wǎng)膜病發(fā)病中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

9 杜蕓;食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)調(diào)控因子的研究及其意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2005年

10 郭小權(quán);高鈣日糧致雞痛風(fēng)的機(jī)理研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐利剛;cyclinD1、p16、cyclinA1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中的表達(dá)及意義[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

2 王本鵬;清熱散瘀湯對(duì)下肢深靜脈血栓形成患者炎癥因子的影響[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

3 邱俊;微循環(huán)障礙與放射性肺損傷的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

4 王美雪;厄貝沙坦抗氧化性的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2011年

5 龔靜青;積雪草提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期及游離鈣的影響[D];暨南大學(xué);2011年

6 顧P";不同艾煙環(huán)境對(duì)小鼠肺組織病理及抗氧化功能影響的研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2011年

7 徐佳曦;心肌細(xì)胞膜PIP_2在心肌肥厚中的作用的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

8 昌國(guó)強(qiáng);N~+離子注入誘變E.coli及胸腺嘧啶缺陷菌的篩選[D];華東理工大學(xué);2011年

9 張勝根;點(diǎn)帶石斑魚(yú)組織中一氧化氮合成酶活性及免疫反應(yīng)性研究[D];天津農(nóng)學(xué)院;2011年

10 劉佳妮;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和缺氧誘導(dǎo)因子-1α在結(jié)核性和腫瘤性心包積液診斷中的價(jià)值[D];華中科技大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2346657