【摘要】：血栓栓塞性疾病嚴重危害人類健康和生命,溶栓療法是治療血栓栓塞性疾病最為有效并且可靠的手段。目前臨床應用的溶栓藥物療效肯定,明顯降低了患者的死亡率和致殘率,但還存在特異性不高、半衰期短、易出血及再栓塞等缺點。因此迫切需要研制開發(fā)高效、特異、安全、副作用小、價廉的新型溶栓藥物。已有研究表明,許多中藥具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用,包括生物堿類、黃酮類以及皂甙等化合物,尤其是活血化瘀中草藥具有不同程度的抗凝血、血小板聚集及溶解血栓的作用。生活在植物組織內的內生菌,由于內生菌與宿主植物長期協(xié)同進化過程中,彼此構成了穩(wěn)定的生態(tài)關系,使內生菌具有產生某些與植物相同或相似化合物的能力。鑒于此,從中藥植物內生菌資源中可尋找和發(fā)現(xiàn)一些新型的溶栓藥物。 本研究首次在內生細菌中篩選分離到一株具有纖溶活性較高和良好體外溶栓效果的EJS-3菌株,對其進行了形態(tài)特征、生理生化特征和分子生物學鑒定,并對內生多粘芽孢桿菌纖溶酶的分離純化及其性質進行深入的研究。同時,采用基因工程技術將內生多粘芽孢桿菌纖溶酶基因克隆到表達載體上,實現(xiàn)內生多粘芽孢桿菌纖溶酶異源表達,并對表達產物的提純和重組酶的酶學性質作了初步探討,為研制和開發(fā)新型的溶栓藥物提供重要理論依據(jù)。主要研究結果分述如下： 1.采用酪蛋白平板和纖維蛋白平板初篩、搖瓶復篩的篩選策略,從金銀花、黃芩、蒲公英、黃連、連翹、爬山虎、魚腥草、百部等植物的根、莖、葉分離篩選到7株具有纖溶活性的內生菌。其中從百部中分離到的內生菌株EJS-3酶活最高,達110 IU/mL。通過對其形態(tài)特征、生理生化特征進行鑒定,初步判斷該菌株為多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。對菌株EJS-3的16S rDNA進行PCR擴增,對得到的1500bpPCR產物純化和序列測定,利用GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源搜索,并構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹,結果表明：菌株EJS-3的16S rDNA序列(DQ120522)與多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的16S rDNA序列的同源性均達98%以上,親緣關系最近。結合常規(guī)的形態(tài)特征、生理生化特征鑒定,表明該菌株在細菌系統(tǒng)分類學上屬于多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。目前,國內外內生多粘芽孢桿菌產纖溶酶的研究尚未見報道。 2.內生菌株EJS-3發(fā)酵液經離心除菌,硫酸銨分級沉淀,Hiprep phenyl FF疏水層析,RESOURCEM Q離子交換層析和Sephacryl S-300HR凝膠過濾,獲得電泳純的多粘芽孢桿菌纖溶酶(PPFE-Ⅰ), HPLC為單一峰,純度為94.1%。每升發(fā)酵液中可獲得1.6 mg活性蛋白,每毫克蛋白活力達2096 IU,純度提高了14.5,回收率為3.3%。 3. SDS-PAGE測定PPFE-Ⅰ的相對分子質量為63 KDa, MALDI-TOF質譜法準確測定其相對分子質量為63.3 KDa。該酶最適反應溫度37℃,最適反應pH7.5,具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。金屬離子Cu2+和Ca2+能抑制其纖溶活性, Mg2+, Fe2+和Zn2+對該酶存在明顯的激活作用。1 mmol/L PMSF完全抑制其纖溶活性,EDTA能部分抑制纖溶活性,這表明PPFE-Ⅰ屬于絲氨酸蛋白酶,此酶還可能是一種金屬蛋白酶。 4.利用幾種人工合成的底物測定水解酰胺鍵活性的高低。結果表明,PPFE-Ⅰ的最適底物是枯草桿菌蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的最適底物,即N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe -pNA;水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的米氏常數(shù)Km為0.20 mM,表明PPFE-Ⅰ對該底物有較好的親和性；PPFE-Ⅰ在普通纖維蛋白平板和加熱平板上測定的纖溶活性沒有顯著的差別,這表明PPFE-Ⅰ對纖維蛋白具有直接的降解作用,不具有激活纖溶酶原形成纖溶酶的活性,因而PPFE-Ⅰ是一種纖溶酶,而不是纖溶酶原激活劑；通過PPFE-Ⅰ對人血纖維蛋白原的體外降解過程的研究,結果表明纖溶酶PPFE-Ⅰ最先降解α鏈,其次是β鏈,而對γ鏈降解最緩慢,1-4 h逐漸降解至完全；通過體外血凝塊的溶解作用實驗,結果表明當PPFE-Ⅰ酶溶液對血凝塊作用24h時,其對體外血凝決的溶解率91.33%,表明PPFE-Ⅰ有明顯的體外溶栓作用,直接溶解作用的結果,同時具有顯著的抗凝活性,并且抗凝血效果優(yōu)于尿激酶。 5.為了實現(xiàn)內生多粘芽孢桿菌纖溶酶的異源高效表達,以內生菌株EJS-3基因組DNA為模板,運用PCR擴增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD-19T載體上,構建克隆載體pMD-PPFE-Ⅰ,經測序正確后,將PPFE-Ⅰ克隆至表達載體pET-DsbA上,成功構建了pET-DsbA/PPFE-Ⅰ重組表達質粒,將其轉化E. coli BL21(DE3)中,在IPTG誘導下實現(xiàn)了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表達,表達產物酶活性達228 IU/mL.表達產物用SDS-PAGE和Western blot進行鑒定。SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白主要以可溶形式表達,占菌體總蛋白的18.4%。Western blot結果表明在相應分子量處有一條特異性條帶,證實該蛋白為DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白。 6.表達產物通過Ni親和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步驟進行分離純化,并用MALDI-TOF質譜對重組酶進行了鑒定。純化后的表達產物在纖維蛋白平板上表現(xiàn)出明顯的纖溶活性。對純化的重組纖溶酶進行最適溫度及其穩(wěn)定性、最適pH及其穩(wěn)定性以及蛋白酶抑制劑、金屬離子的影響等性質的研究,結果表明,重組酶與天然纖溶酶是一致的。 7.為了進一步探討內生多粘芽孢桿菌纖溶酶基因異源表達特性,從內生菌株EJS-3總DNA中PCR擴增出PPFE-Ⅰ基因,將PPFE-Ⅰ基因克隆到本實驗室構建大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質粒pHPQ中,并轉化枯草桿菌WB800中進行了分泌表達,在含氯霉素10μg/mL.紅霉素10μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)32h,纖溶酶活性為60 IU/mL.
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【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2344976