【摘要】：背景：殼寡糖（COS）是殼聚糖的降解產(chǎn)物，由于具有分子量小、沒有毒性、容易吸收以及水溶性好等特點，較殼聚糖能夠發(fā)揮更重要的生物學(xué)功能。殼寡糖在提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、促進(jìn)傷口愈合等方面具有重要的應(yīng)用價值。近年來殼寡糖在提高免疫力、抗腫瘤方面的研究受到很大關(guān)注。前期研究表明殼寡糖能夠調(diào)節(jié)機體的免疫功能，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但是殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的機制尚未見詳細(xì)報道。 方法：本項目通過殼聚糖酶水解法水解殼聚糖制備殼寡糖，高效液相色譜法（HPLC）對殼寡糖產(chǎn)物的成分進(jìn)行鑒定。在體外研究了不同濃度殼寡糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞吞噬中性紅能力以及分泌α-腫瘤壞死因子（TNF-α）能力的影響。對小鼠灌胃不同劑量的殼寡糖，在體內(nèi)研究了殼寡糖對小鼠血清中免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）含量以及小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響。用異硫氰酸酯熒光素（FITC）將殼寡糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，制備FITC-COS；以巨噬細(xì)胞系RAW264.7為對象，研究巨噬細(xì)胞對殼寡糖的吞噬作用以及探究TLR4受體在吞噬過程中扮演的關(guān)鍵角色，研究殼寡糖對巨噬細(xì)胞分泌NO能力的影響以及TLR4受體沉默對巨噬細(xì)胞分泌功能的影響，初步比較殼寡糖混合物、殼五糖和殼六糖功能的異同，并用RT-PCR法檢測殼寡糖對RAW264.7細(xì)胞TNF-α，iNOS，TLR4等基因轉(zhuǎn)錄的影響。 結(jié)果：HPLC分析結(jié)果顯示殼聚糖酶水解法制備的殼寡糖主要為3~7單糖聚合度的寡糖。殼寡糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能：體外研究表明殼寡糖被巨噬細(xì)胞吞噬后可顯著增強巨噬細(xì)胞的增殖功能，刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α；體內(nèi)研究結(jié)果表明小鼠灌胃殼寡糖能夠顯著增加小鼠的脾臟指數(shù)，增加血清中IgG的含量，對胸腺指數(shù)和血清中IgM的含量沒有顯著影響。將FITC-COS作用于巨噬細(xì)胞不同時間后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明巨噬細(xì)胞能夠吞噬殼寡糖，隨著時間的延長細(xì)胞吞噬殼寡糖的量不斷增加，在15min左右達(dá)到吞噬高峰；TLR4單克隆抗體預(yù)處理巨噬細(xì)胞1h后再加入FITC-COS，巨噬細(xì)胞對殼寡糖的吞噬作用幾乎完全被抑制。殼寡糖能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，提高其吞噬中性紅的能力，以及分泌NO的能力，各類寡糖糖樣中以殼六糖的效果最好。TLR4單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞后再加入COS，RAW264.7細(xì)胞分泌NO的能力急劇降低。殼寡糖能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF，iNOS，，TLR4等基因轉(zhuǎn)錄，但結(jié)果仍需進(jìn)一步探討。 結(jié)論：殼寡糖（3~7聚合度）能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞，具有較好的體外、體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能，殼寡糖對巨噬細(xì)胞的激活是通過細(xì)胞表面TLR4受體參與介導(dǎo)的。
[Abstract]:Background: chitosan oligosaccharide (COS) is the degradation product of chitosan. Because of its small molecular weight, no toxicity, easy absorption and good water solubility, chitosan can play a more important biological function than chitosan. Chitosan oligosaccharide has important application value in improving immunity, anti-tumor, anti-oxidation, anti-bacterial and promoting wound healing. In recent years, the research of chitosan oligosaccharide in improving immunity and anti-tumor has received great attention. Previous studies have shown that chitosan can regulate immune function and inhibit tumor growth and metastasis, but the mechanism of interaction between chitosan oligosaccharide and macrophage has not been reported in detail. Methods: chitosan was hydrolyzed by enzymatic hydrolysis of chitosan. The components of chitosan oligosaccharides were identified by (HPLC). The effects of different concentrations of chitosan oligosaccharides on the proliferation, phagocytosis of neutrophil and the secretion of 偽-tumor necrosis factor (TNF- 偽) of mouse peritoneal macrophages were studied in vitro. The effects of chitosan oligosaccharides on the contents of immunoglobulin G (IgG) and immunoglobulin M (IgM) in serum, thymus and spleen index of mice were studied in vivo. Chitosan oligosaccharides were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) to prepare FITC-COS;. The phagocytosis of macrophages to chitosan oligosaccharide and the key role of TLR4 receptor in phagocytosis were studied in the macrophage cell line RAW264.7. To study the effect of chitosan oligosaccharide on the secretion of NO by macrophages and the effect of TLR4 receptor silencing on the secretion function of macrophages, and to compare the functions of chitosan oligosaccharide mixture, chitosan pentaccharide and chitosan hexose. The effect of chitosan oligosaccharide on the transcription of TNF- 偽, iNOS,TLR4 and other genes in RAW264.7 cells was detected by RT-PCR assay. Results: the results of HPLC analysis showed that the main chitosan oligosaccharides prepared by enzymatic hydrolysis of chitosan were 3 / 7 monosaccharide oligosaccharides with degree of polymerization. Chitosan oligosaccharide has good immunomodulatory function: in vitro studies showed that chitosan oligosaccharide phagocytosis significantly enhanced the proliferation of macrophages and stimulated macrophages to secrete TNF- 偽; The results in vivo showed that chitosan oligosaccharide could significantly increase the spleen index and the content of IgG in serum, but had no significant effect on the thymus index and the content of IgM in serum. After treated with FITC-COS for different time, the results of fluorescence microscope showed that macrophages could swallow chitosan oligosaccharide, and the amount of chitosan oligosaccharide was increased with time, and reached the phagocytosis peak around 15min. The phagocytosis of oligosaccharide was almost completely inhibited by TLR4 monoclonal antibody pretreating macrophage for 1 h and then adding FITC-COS, macrophage. Chitosan oligosaccharide can promote the proliferation of RAW264.7 cells, improve its ability of phagocytosis of neutral red, as well as the ability to secrete NO. Chitosan has the best effect in all kinds of oligosaccharides. TLR4 monoclonal antibody pretreated the cells and then added COS,. The ability of RAW264.7 cells to secrete NO decreased sharply. Chitosan oligosaccharides can induce transcription of TNF,iNOS,TLR4 and other genes in macrophages, but the results need further study. Conclusion: chitosan can be phagocytized by macrophages and then activate macrophages. It has good immunomodulatory function in vitro. The activation of chitosan oligosaccharides on macrophages is mediated by TLR4 receptor on the surface of macrophages.
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392.1

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本文編號：2345019