【摘要】： 研究背景及目的: 急性髓細(xì)胞白血病是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,骨髓中白血病細(xì)胞大量增殖,抑制正常造血,導(dǎo)致患者中性粒細(xì)胞減少、貧血、血小板減少。如果不進(jìn)行治療,患者將在數(shù)周內(nèi)死于出血和感染。目前對于急性髓細(xì)胞白血病的治療,仍然以化療為主,但因大多數(shù)化療藥物選擇性差,毒副作用大,對正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有較大的損害,因此長期大劑量使用受到限制。但由于腫瘤的病因和發(fā)展機(jī)制還未充分了解,尚未能有效的防治腫瘤。要抑制腫瘤細(xì)胞的生長,一方面可以通過影響細(xì)胞周期,使其不能進(jìn)行正常的有絲分裂,另一方面可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡,以達(dá)到治療目的。 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)屬真球目弓形蟲科,是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,可寄生于人和動物有核細(xì)胞內(nèi)引起弓形蟲病。研究表明弓形蟲可誘發(fā)宿主細(xì)胞凋亡。本文探索弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清對人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1的細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。觀察弓形蟲培養(yǎng)上清對體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期的影響,探討弓形蟲培養(yǎng)上清是否對THP-1細(xì)胞具有增殖抑制作用;觀察弓形蟲培養(yǎng)上清對THP-1細(xì)胞凋亡的影響;觀察弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細(xì)胞后P-p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和凋亡基因蛋白Fas、FasL表達(dá)的變化,探討弓形蟲培養(yǎng)上清誘導(dǎo)THP-1凋亡的相關(guān)機(jī)制。 方法: 1.采用倒置顯微鏡觀察THP-1細(xì)胞形態(tài)變化情況;采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測弓形蟲培養(yǎng)上清對THP-1細(xì)胞增殖抑制率;采用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布; 2.AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化,觀察細(xì)胞各期特征變化; Annexin V- FITC/PI雙染法檢測弓形蟲培養(yǎng)上清作用后THP-1細(xì)胞早期凋亡。 3.免疫疫細(xì)胞化學(xué)法觀察弓形蟲培養(yǎng)上清處理后細(xì)胞內(nèi)磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)、Fas和FasL蛋白表達(dá)及分布變化;采用Western blot檢測弓形蟲培養(yǎng)上清處理前后細(xì)胞內(nèi)P-p38MAPK、Fas和FasL蛋白表達(dá)量的變化。 結(jié)果: 1.MTT法檢測顯示弓形蟲培養(yǎng)上清能抑制THP-1細(xì)胞增殖,并呈時間 濃度依賴性。FCM檢測弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細(xì)胞72h后,G0/G1期細(xì)胞比率明顯上升,而S期比率明顯下降。弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細(xì)胞72h后均出現(xiàn)凋亡峰,呈濃度依賴性,與對照組比較有顯著差異(p0.01)。 2.弓形蟲培養(yǎng)上清作用THP-1細(xì)胞后,經(jīng)AO/EB染色,在熒光顯微鏡下觀察,可出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。隨著弓形蟲培養(yǎng)上清濃度的增加可見凋亡細(xì)胞增多,且以晚期凋亡細(xì)胞增多為主,呈濃度依賴性;Annexin V- FITC/PI雙染法顯示弓形蟲培養(yǎng)上清(3.2×107/ml,6.4×107/ml)作用THP-1細(xì)胞72h后細(xì)胞凋亡率分別為(27.8267±1.1667)%和(45.283 3±1.3372)%,呈濃度依賴性,與對照組比較有顯著差異(p0.01)。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測藥物處理后P-p38MAPK表達(dá)增加,主要分布于細(xì)胞核與細(xì)胞漿,而陰性對照組僅弱表達(dá)。Fas、FasL蛋白上調(diào),主要分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜;Western blot法顯示P-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表達(dá)量隨上清液濃度的增加而增加,呈濃度依賴性。其陰性組、72h的1/2IC50組、IC50組P-p38MAPK蛋白表達(dá)水平(相對灰度值)分別為0.2598±0.0132,0.3612±0.0083和0.5056±0.0055;Fas蛋白表達(dá)水平分別0.2874±0.0089,0.4268±0.0079和0.5971±0.0109;FasL蛋白表達(dá)水平分別為0.2124±0.0141 , 0.2988±0.0280和0.4087±0.0266;差別均有顯著性意義( p 0.01)。 結(jié)論: 1.弓形蟲培養(yǎng)上清對THP-1細(xì)胞生長具有明顯的增殖抑制作用,呈時間 濃度依賴性。 2.弓形蟲培養(yǎng)上清能影響THP-1細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 3.弓形蟲培養(yǎng)上清誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡機(jī)制之一可能是通過激活P-p38MAPK/Fas/FasL途徑?
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R382

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本文編號：2331171