【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)的感染呈世界流行趨勢,是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因之一,近年來HCV感染率呈上升趨勢,嚴(yán)重威脅著人類的健康。由于細(xì)胞模型與模式動物的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢,目前尚無疫苗研制成功,因此研發(fā)更有效的病毒藥物迫在眉睫。HCV RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp),是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶,在正常的宿主細(xì)胞中不存在該酶的同系物,因此可以作為抗病毒研究的一個(gè)良好靶標(biāo),已用于體外篩選HCV抑制劑。體外篩選HCV RdRp抑制劑的關(guān)鍵是獲得溶解性好、活性高的HCV RdRp蛋白,而該蛋白的C端對其酶活性及水溶性有影響。 表達(dá)具有良好溶解性和酶活性的重組蛋白,對于建立RdRp活性體外測定方法具有重要意義。由于不同蛋白在不同系統(tǒng)中表達(dá)水平有顯著差異,其對目的蛋白的生物活性也有較大影響,所以選擇一種合適的表達(dá)系統(tǒng)對蛋白表達(dá)水平非常關(guān)鍵。目前可供選擇的有各種不同的表達(dá)體系如細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、酵母、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。 本研究選擇了大腸桿菌、畢赤酵母及中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)三種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行HCV RdRp重組蛋白的表達(dá),成功構(gòu)建了三種適用于不同表達(dá)系統(tǒng)的C端截短21個(gè)氨基酸的RdRp重組質(zhì)粒: pet28a(+)-HCV-RdRp , pPICZα-HCV-RdRp和pcDNA3.1-HCV-RdRp,分別在大腸桿菌、畢赤酵母及哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)及鑒定。 對影響大腸桿菌中蛋白可溶性表達(dá)水平的多種因素進(jìn)行優(yōu)化,探討了誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度及時(shí)間、誘導(dǎo)劑IPTG濃度等對重組蛋白可溶性表達(dá)的影響,篩選出了提高可溶表達(dá)該蛋白的最適條件。在最佳條件下,SDS-PAGE顯示可以獲得最多的可溶性表達(dá)蛋白,以Ni柱純化后獲得了純化較好的HCV RdRp重組蛋白,Western blot檢測蛋白具有特異性,實(shí)現(xiàn)了HCV RdRp蛋白在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)。 通過優(yōu)化pcDNA3.1載體中的序列,在5’端酶切位點(diǎn)之后插入轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列、起始密碼子、人IgG輕鏈可變區(qū)信號肽及8×His標(biāo)簽,促使蛋白分泌到細(xì)胞外,以增加細(xì)胞表達(dá)上清中HCV RdRp的獲得量,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,經(jīng)競爭ELISA法檢測在CHO細(xì)胞上清中獲得了特異性HCV-RdRp的分泌表達(dá),表達(dá)量較低,Ni柱純化得到重組蛋白。 將克隆有HCV RdRp基因的酵母表達(dá)載體pPICZα-HCV-RdRp電轉(zhuǎn)化酵母菌GS115,挑取酵母轉(zhuǎn)化單菌落30℃下甲醇誘導(dǎo),誘導(dǎo)后上清進(jìn)行Western blot分析,未能檢測出其在酵母中的分泌表達(dá)。 將純化的可溶性表達(dá)的HCV RdRp用于酶活性體外測定方法的建立,納米磁分離、酶聯(lián)等技術(shù)相結(jié)合,建立了一種體外檢測RdRp聚合酶活性的新方法。將RNA模板修飾固定在核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合磁性納米顆粒上并置于磁架上,再加入純化的RdRp蛋白,rNTP,Bio-16-UTP等構(gòu)成反應(yīng)體系。通過摻入生物素標(biāo)記單體,利用RNA依賴的RNA聚合酶的活性,使另一條RNA鏈得到延伸,在外磁場下分離除去非特異性吸附片段,再與酶標(biāo)記的親和素結(jié)合,洗滌后,向微孔內(nèi)加入底物顯色劑,通過是否顯色來判定RdRp活性。初步建立體外檢測HCV RdRp活性的新方法后,對參與體外復(fù)制的諸因素的反應(yīng)濃度進(jìn)行了優(yōu)化,篩選出最佳反應(yīng)條件。將建立的活性測定方法應(yīng)用于對抗病毒中藥庫的40種中藥成分進(jìn)行RdRp抑制劑的篩選,暫時(shí)尚未篩選到有效的抑制劑,對中藥庫中其他成分的篩選等后續(xù)實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。本方法可直接通過顯色來檢測HCV RNA依賴的RNA聚合酶活性,并且可以移至96孔板內(nèi)進(jìn)行高通量檢測,為高通量篩選HCV RdRp抑制劑奠定了基礎(chǔ)。該研究思路國內(nèi)外尚未見報(bào)道過,具有原始創(chuàng)新性,已申請專利。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2331035