【摘要】： 煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus, A.fumigatus)是一種分布廣泛的真菌,其孢子體積很小,易于進(jìn)入呼吸道,是一種常見的呼吸道過敏原,生長過程中可以釋放多種蛋白酶,在哮喘發(fā)病中的作用近年來逐漸受到重視。呼吸道上皮細(xì)胞在過敏原致敏和哮喘發(fā)作中起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物哮喘模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)方面闡述煙曲霉菌對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制,進(jìn)一步闡明煙曲霉菌在哮喘早期致敏和加重發(fā)病中的作用機(jī)制。 第一章煙曲霉菌孢子對(duì)大鼠呼吸道結(jié)構(gòu)和功能的影響 目的:探討煙曲霉菌孢子對(duì)正常和哮喘大鼠呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。 方法:應(yīng)用OVA致敏的方法建立大鼠的哮喘模型。應(yīng)用煙曲霉菌孢子給予滴鼻后觀察煙曲霉菌孢子對(duì)正常和哮喘大鼠的氣道反應(yīng)性。測定肺泡灌洗液(BALF)粘液蛋白Muc5ac和粒-巨細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF水平。 結(jié)果:接觸煙曲霉菌孢子的大鼠與正常大鼠比較,BALF上清中Muc5ac和GM-CSF明顯增高,氣道對(duì)乙酰膽堿反應(yīng)性明顯增高。接觸煙曲霉菌孢子的哮喘大鼠與未接觸煙曲霉菌孢子的哮喘大鼠相比,前者BALF內(nèi)Muc5ac和GM-CSF水平和氣道對(duì)乙酰膽堿的反應(yīng)性明顯高于后者。 結(jié)論:煙曲霉菌孢子可以增加正常和哮喘大鼠氣道反應(yīng)性,促進(jìn)氣道合成分泌Muc5ac和GM-CSF。煙曲霉菌可能通過上述的途徑促進(jìn)大鼠哮喘發(fā)生和加重其發(fā)展。 第二章煙曲霉菌提取物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的作用 目的:探討煙曲霉菌對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制。 方法:制備并鑒定煙曲霉菌提取物(AFE),觀察AFE體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE-14o)的跨上皮細(xì)胞電阻(TER)、緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1、細(xì)胞體外修復(fù)功能、細(xì)胞合成分泌Muc5ac和GM-CSF的作用。應(yīng)用熱處理-AFE(HT-AFE)、絲氨酸蛋白酶抑制劑、蛋白激酶激活受體-2(PAR-2)的激動(dòng)劑或者阻斷劑進(jìn)一步研究其可能機(jī)制。 結(jié)果:制備的AFE具有明顯的蛋白酶活性和絲氨酸蛋白酶活性,且熱處理(65℃,30min)后其蛋白酶活性完全消失,應(yīng)用2mg/L抑肽酶可以完全抑制其絲氨酸蛋白酶活性。160mg/L AFE作用4h不影響細(xì)胞的活力和細(xì)胞上清中的乳酸脫氫酶的水平。 40-160mg/L AFE作用于單層極化細(xì)胞的基底層時(shí)作用6min左右可以引起TER快速短暫的降低,隨后逐漸恢復(fù)而后在4h又逐漸降低。而作用于單層極化細(xì)胞的上層時(shí)并沒有出現(xiàn)快速短暫的降低,只出現(xiàn)一個(gè)隨時(shí)間逐漸降低的過程。應(yīng)用PAR-2激活肽可以模擬6min時(shí)的快速短暫的降低。應(yīng)用免疫熒光和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)AFE可以明顯降解緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin,并呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。而對(duì)ZO-1沒有明顯的影響。另外抑肽酶可以抑制AFE對(duì)細(xì)胞TER和occludin的作用。HT-AFE對(duì)細(xì)胞TER和occludin沒有明顯影響。 20-40mg/L AFE可以明顯降低細(xì)胞的體外損傷修復(fù)功能、細(xì)胞移動(dòng)功能、細(xì)胞的粘附功能和細(xì)胞的伸展功能,而HT-AFE對(duì)細(xì)胞的上述修復(fù)功能指標(biāo)沒有明顯的作用。 8-24mg/LAFE可以促進(jìn)上皮細(xì)胞合成和分泌Muc5ac和GM-CSF,呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性,同時(shí)AFE明顯促進(jìn)Muc5ac和GM-CSF的mRNA的表達(dá),且抑肽酶和PAR-2受體阻斷劑(FSLLRY-NH2)可以明顯抑制AFE對(duì)Muc5ac和GM-CSF的作用。PAR-2激活肽(SLIGLV- NH2)可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生GM-CSF。另外HT-AFE對(duì)Muc5ac和GM-CSF沒有明顯的作用。 結(jié)論:40-160mg/L AFE可以通過刺激PAR-2受體和直接降解緊密連接蛋白o(hù)ccludin來降低細(xì)胞的屏障功能。20-40mg/L AFE可以降低細(xì)胞的體外損傷修復(fù)功能。8-24mg/L AFE可能通過激活PAR-2受體促進(jìn)細(xì)胞合成分泌Muc5ac和GM-CSF。煙曲霉菌可能通過上述的作用途徑促進(jìn)哮喘過敏原的致敏和加重哮喘的發(fā)作程度。PAR-2和蛋白酶抑制劑可能成為未來預(yù)防和治療哮喘的靶點(diǎn)和新的治療途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R379;R562.25;R519

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本文編號(hào)：2312464