【摘要】：結(jié)核病分子流行病學(xué)研究在探索結(jié)核病感染傳播機(jī)制和流行規(guī)律等方面具有非常重要的作用,分子流行病學(xué)研究的核心技術(shù)是分子分型技術(shù)。IS6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(IS6110restriction fragment length polymorphism, IS6110-RFLP)、間隔寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, Spoligotyping)及多位點(diǎn)可變數(shù)目重復(fù)單元分析[Multiple Loci VNTR (variable number tandem repeats) Analysis, MLVA]三種方法是目前結(jié)核病分子流行病學(xué)研究實(shí)際工作中最經(jīng)常使用的方法,被廣泛研究和應(yīng)用,在結(jié)核病的病原學(xué)、流行病學(xué)、感染發(fā)病機(jī)制等諸多方面的研究中發(fā)揮了重要作用。 首先為研究建立適合于中國(guó)結(jié)核分枝桿菌分子分型和分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化的MLVA技術(shù),本研究通過(guò)對(duì)128株結(jié)核分枝桿菌的46個(gè)VNTR位點(diǎn)的分析,首先考慮位點(diǎn)的PCR方法可操作性、及PCR結(jié)果的判讀等方面因素,根據(jù)各個(gè)位點(diǎn)的PCR結(jié)果圖片首先排除掉Qub11b等13個(gè)0結(jié)果比較多的位點(diǎn)和Rv1895等3個(gè)PCR結(jié)果條帶復(fù)雜不易辨識(shí)的位點(diǎn)；然后根據(jù)分辨率高低及合并位點(diǎn)分辨率,初步確定了16個(gè)位點(diǎn)(Mtub21、MIRU26、Qub26、Qub11-a、 ETRE、Mtub04、MIRU10、MIRU16、MIRU40、Mtub30、ETRA、MIRU39、 Mtub38、Mtub39、ETR-F、ETRD)作為標(biāo)準(zhǔn)操作方案選用的位點(diǎn)。 通過(guò)計(jì)算Hunter-Gaston指數(shù),對(duì)國(guó)際上比較常用的幾種位點(diǎn)組合如12個(gè)MIRU位點(diǎn)(Oldl2),12個(gè)MIRU位點(diǎn)加3個(gè)ETR位點(diǎn)(Old12+ETR),和2006年Supply等研究的15個(gè)位點(diǎn)及24個(gè)位點(diǎn)組合,同本研究提出的16個(gè)位點(diǎn)組合的分型分辨率進(jìn)行比較。結(jié)果Supply提出的24個(gè)位點(diǎn)及本研究確定的16個(gè)位點(diǎn)的分辨率為最高,達(dá)到0.999,Supply提出的15個(gè)位點(diǎn)組合的分辨率為0.998,近似于24及16位點(diǎn),而O1d12位點(diǎn)及Old12+ETR位點(diǎn)組合的分辨率比較低。 而后應(yīng)用本研究確定的16個(gè)位點(diǎn)組合的MLVA方法,以及參考文獻(xiàn)發(fā)表的IS6110-RFLP、Spoligotyping分型方法標(biāo)準(zhǔn)操作,對(duì)我國(guó)126株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株及H37Rv和BCG標(biāo)準(zhǔn)菌株,共128株進(jìn)行分型研究。了解三種分型方法對(duì)中國(guó)部分地區(qū)菌株分型能力,以及對(duì)在中國(guó)占絕大多數(shù)的菌株類(lèi)型----北京家族菌株中的分型能力做進(jìn)一步研究。 16位點(diǎn)MLVA方法將128株結(jié)核分枝桿菌分成11個(gè)簇。共有120個(gè)基因型,其中115個(gè)獨(dú)特型,計(jì)算的HGI為0.999(可信區(qū)間0.998-0.999)；102株北京家族菌株分成94個(gè)基因型,獨(dú)特型89個(gè)。將MLVA結(jié)果數(shù)據(jù)提交至MIRU-VNTRplus(http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/aboutus.faces)網(wǎng)站,同其他國(guó)家菌株結(jié)果相比較,我國(guó)的126株菌株MLVA結(jié)果具有一定的聚集性,同其他國(guó)家菌株結(jié)果有明顯的區(qū)別,絕大多數(shù)菌株形成一簇,同菌株庫(kù)中北京家族菌株分在一起,其他一些菌株呈散在分布。 通過(guò)計(jì)算分辨率指數(shù),16個(gè)位點(diǎn)的MLVA分型分辨率僅次于IS6110-RFLP,而Spoligotyping分型的分辨率比較低,并且MLVA分型同IS6110-RFLP的符合度達(dá)到91.1%。考慮到IS6110-RFLP操作困難結(jié)果不易判定等缺點(diǎn),16個(gè)位點(diǎn)的MLVA分型在分辨率上近似IS6110-RFLP,完全可以作為一線分型方法,在中國(guó)結(jié)核分枝桿菌分子分型研究中使用。 本研究還發(fā)現(xiàn)1株西藏CAS家族菌株,和兩株Spoligotyping結(jié)果近似的新疆菌株,3株菌株的MLVA結(jié)果也比較相似,都分在MG9一簇,但I(xiàn)S6110-RFLP結(jié)果相距比較遠(yuǎn),3株菌還存在比較大的差異,這2株新疆菌株是否能劃分為CAS家族還需要進(jìn)一步的研究。由于CAS家族菌株通常分布于印度等地區(qū),分析這1株西藏CAS菌株可能是由旅游者攜帶入境。 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymophism, SNP)是非常有用的遺傳標(biāo)識(shí),以此為基礎(chǔ)的多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)分析也成為近年發(fā)展起來(lái)的新型分型方法。MLST是基于病原微生物管家基因位點(diǎn)上的單核苷酸變異(多態(tài)性)建立的分型方法。目前已經(jīng)有MLST分析網(wǎng)站(www.mist.net和http://pubmlst.org),收錄了許多病原體資料,已建立了腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、空腸彎曲菌、幽門(mén)螺桿菌等18種原核生物及白色念珠菌等真核生物的MLST庫(kù),但是尚沒(méi)有結(jié)核分枝桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)。 本研究用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核室CCDC05079及CCDC05180兩株已經(jīng)完成全基因組測(cè)序的菌株序列,以及NCBI發(fā)布的H37Rv全基因序列,經(jīng)三株菌株全基因比對(duì),選擇有差異的管家基因,進(jìn)行MLST分型研究,計(jì)算分辨率指數(shù),選擇分辨率最高的7個(gè)管家基因(rmlC、mpt53、panD、 gcvH、recX、mprA和ideR)作為此次MLST分型的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。49株結(jié)核分枝桿菌的7個(gè)管家基因測(cè)序結(jié)果用MEGA4軟件進(jìn)行分型研究,用NJ方法繪制的菌株進(jìn)化關(guān)系圖,由rmlC基因片段上兩個(gè)SNP(rmlC101G→C、rmlC345A→C)變異將49株菌株分成兩個(gè)部分,并且這兩個(gè)SNP都引起氨基酸的變異(RmlC34G→A、 RmlC115E→D)。rmlC基因編碼RmlC (dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3,5表異構(gòu)酶),參與dTDP-鼠李糖代謝,而L-鼠李糖是維持分枝桿菌細(xì)胞壁完整性,參與分枝桿菌生長(zhǎng)的重要物質(zhì),參與其代謝的任何一種酶都對(duì)分枝桿菌生長(zhǎng)至關(guān)重要,而兩簇菌株在rmlC基因片段上的區(qū)別提示兩簇菌株潛在的生長(zhǎng)情況差異。 MLST引入的基因片段還包括panD、ideR、mprA等毒力相關(guān)的基因片段。MLST分型引入毒力相關(guān)基因能夠?qū)⒕攴中唾Y料與毒力因素相聯(lián)系,不但在研究疾病的流行傳播情況及追溯傳染源的方面具有良好的應(yīng)用前景,而且在結(jié)核分枝桿菌型別與致病力聯(lián)系方面的研究也具有重要的意義。 另外,比對(duì)多個(gè)基因片段的核酸序列,并將每一組不同的等位基因的排列組合作為一個(gè)基因型,即一個(gè)序列型(Sequence-typying, STs)。這些以等位基因STs編號(hào)為基本分析單位,通過(guò)相關(guān)序列的運(yùn)算法則BURST(Based upon related sequence types)分析與其有親緣關(guān)系的基因類(lèi)型,將49菌株一共分成40個(gè)STs,以ST9和ST2為中心的克隆群是菌株數(shù)量最多的,共有菌株20株,是主要的流行克隆群。49株菌株的7個(gè)管家基因片段一共有62個(gè)SNP位點(diǎn),成為建立MLST數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 闞曉宏,萬(wàn)康林,金玉蓮,劉敬華,楊建安,劉志廣,丁虹,趙秀琴,王慶,唐婧;DNA數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列用于結(jié)核分枝桿菌分型研究[J];中國(guó)防癆雜志;2005年02期

2 查佳,高謙;MIRU-新的結(jié)核分枝桿菌基因型分型方法簡(jiǎn)介[J];中國(guó)防癆雜志;2005年03期

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5 石荔;楊敏;Christine Pourcel;董海燕;尼瑪彭多;張嬡媛;朗珍;呂冰;蔣毅;魏淑貞;范昕建;萬(wàn)康林;;MLVA和Spoligotyping用于西藏地區(qū)216株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因分型研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2007年08期

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7 曹曉慧;劉志廣;趙秀芹;呂冰;張媛媛;萬(wàn)康林;;220株結(jié)核分枝桿菌北京臨床分離株的基因分型研究[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2008年05期

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本文編號(hào)：2308040