【摘要】：結(jié)核病分子流行病學(xué)研究在探索結(jié)核病感染傳播機制和流行規(guī)律等方面具有非常重要的作用,分子流行病學(xué)研究的核心技術(shù)是分子分型技術(shù)。IS6110限制性片段長度多態(tài)性(IS6110restriction fragment length polymorphism, IS6110-RFLP)、間隔寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, Spoligotyping)及多位點可變數(shù)目重復(fù)單元分析[Multiple Loci VNTR (variable number tandem repeats) Analysis, MLVA]三種方法是目前結(jié)核病分子流行病學(xué)研究實際工作中最經(jīng)常使用的方法,被廣泛研究和應(yīng)用,在結(jié)核病的病原學(xué)、流行病學(xué)、感染發(fā)病機制等諸多方面的研究中發(fā)揮了重要作用。 首先為研究建立適合于中國結(jié)核分枝桿菌分子分型和分子流行病學(xué)監(jiān)測的標準化的MLVA技術(shù),本研究通過對128株結(jié)核分枝桿菌的46個VNTR位點的分析,首先考慮位點的PCR方法可操作性、及PCR結(jié)果的判讀等方面因素,根據(jù)各個位點的PCR結(jié)果圖片首先排除掉Qub11b等13個0結(jié)果比較多的位點和Rv1895等3個PCR結(jié)果條帶復(fù)雜不易辨識的位點；然后根據(jù)分辨率高低及合并位點分辨率,初步確定了16個位點(Mtub21、MIRU26、Qub26、Qub11-a、 ETRE、Mtub04、MIRU10、MIRU16、MIRU40、Mtub30、ETRA、MIRU39、 Mtub38、Mtub39、ETR-F、ETRD)作為標準操作方案選用的位點。 通過計算Hunter-Gaston指數(shù),對國際上比較常用的幾種位點組合如12個MIRU位點(Oldl2),12個MIRU位點加3個ETR位點(Old12+ETR),和2006年Supply等研究的15個位點及24個位點組合,同本研究提出的16個位點組合的分型分辨率進行比較。結(jié)果Supply提出的24個位點及本研究確定的16個位點的分辨率為最高,達到0.999,Supply提出的15個位點組合的分辨率為0.998,近似于24及16位點,而O1d12位點及Old12+ETR位點組合的分辨率比較低。 而后應(yīng)用本研究確定的16個位點組合的MLVA方法,以及參考文獻發(fā)表的IS6110-RFLP、Spoligotyping分型方法標準操作,對我國126株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株及H37Rv和BCG標準菌株,共128株進行分型研究。了解三種分型方法對中國部分地區(qū)菌株分型能力,以及對在中國占絕大多數(shù)的菌株類型----北京家族菌株中的分型能力做進一步研究。 16位點MLVA方法將128株結(jié)核分枝桿菌分成11個簇。共有120個基因型,其中115個獨特型,計算的HGI為0.999(可信區(qū)間0.998-0.999)；102株北京家族菌株分成94個基因型,獨特型89個。將MLVA結(jié)果數(shù)據(jù)提交至MIRU-VNTRplus(http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/aboutus.faces)網(wǎng)站,同其他國家菌株結(jié)果相比較,我國的126株菌株MLVA結(jié)果具有一定的聚集性,同其他國家菌株結(jié)果有明顯的區(qū)別,絕大多數(shù)菌株形成一簇,同菌株庫中北京家族菌株分在一起,其他一些菌株呈散在分布。 通過計算分辨率指數(shù),16個位點的MLVA分型分辨率僅次于IS6110-RFLP,而Spoligotyping分型的分辨率比較低,并且MLVA分型同IS6110-RFLP的符合度達到91.1%�？紤]到IS6110-RFLP操作困難結(jié)果不易判定等缺點,16個位點的MLVA分型在分辨率上近似IS6110-RFLP,完全可以作為一線分型方法,在中國結(jié)核分枝桿菌分子分型研究中使用。 本研究還發(fā)現(xiàn)1株西藏CAS家族菌株,和兩株Spoligotyping結(jié)果近似的新疆菌株,3株菌株的MLVA結(jié)果也比較相似,都分在MG9一簇,但IS6110-RFLP結(jié)果相距比較遠,3株菌還存在比較大的差異,這2株新疆菌株是否能劃分為CAS家族還需要進一步的研究。由于CAS家族菌株通常分布于印度等地區(qū),分析這1株西藏CAS菌株可能是由旅游者攜帶入境。 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymophism, SNP)是非常有用的遺傳標識,以此為基礎(chǔ)的多位點序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)分析也成為近年發(fā)展起來的新型分型方法。MLST是基于病原微生物管家基因位點上的單核苷酸變異(多態(tài)性)建立的分型方法。目前已經(jīng)有MLST分析網(wǎng)站(www.mist.net和http://pubmlst.org),收錄了許多病原體資料,已建立了腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等18種原核生物及白色念珠菌等真核生物的MLST庫,但是尚沒有結(jié)核分枝桿菌MLST數(shù)據(jù)庫。 本研究用中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核室CCDC05079及CCDC05180兩株已經(jīng)完成全基因組測序的菌株序列,以及NCBI發(fā)布的H37Rv全基因序列,經(jīng)三株菌株全基因比對,選擇有差異的管家基因,進行MLST分型研究,計算分辨率指數(shù),選擇分辨率最高的7個管家基因(rmlC、mpt53、panD、 gcvH、recX、mprA和ideR)作為此次MLST分型的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。49株結(jié)核分枝桿菌的7個管家基因測序結(jié)果用MEGA4軟件進行分型研究,用NJ方法繪制的菌株進化關(guān)系圖,由rmlC基因片段上兩個SNP(rmlC101G→C、rmlC345A→C)變異將49株菌株分成兩個部分,并且這兩個SNP都引起氨基酸的變異(RmlC34G→A、 RmlC115E→D)。rmlC基因編碼RmlC (dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3,5表異構(gòu)酶),參與dTDP-鼠李糖代謝,而L-鼠李糖是維持分枝桿菌細胞壁完整性,參與分枝桿菌生長的重要物質(zhì),參與其代謝的任何一種酶都對分枝桿菌生長至關(guān)重要,而兩簇菌株在rmlC基因片段上的區(qū)別提示兩簇菌株潛在的生長情況差異。 MLST引入的基因片段還包括panD、ideR、mprA等毒力相關(guān)的基因片段。MLST分型引入毒力相關(guān)基因能夠?qū)⒕攴中唾Y料與毒力因素相聯(lián)系,不但在研究疾病的流行傳播情況及追溯傳染源的方面具有良好的應(yīng)用前景,而且在結(jié)核分枝桿菌型別與致病力聯(lián)系方面的研究也具有重要的意義。 另外,比對多個基因片段的核酸序列,并將每一組不同的等位基因的排列組合作為一個基因型,即一個序列型(Sequence-typying, STs)。這些以等位基因STs編號為基本分析單位,通過相關(guān)序列的運算法則BURST(Based upon related sequence types)分析與其有親緣關(guān)系的基因類型,將49菌株一共分成40個STs,以ST9和ST2為中心的克隆群是菌株數(shù)量最多的,共有菌株20株,是主要的流行克隆群。49株菌株的7個管家基因片段一共有62個SNP位點,成為建立MLST數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378.911

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：2308040