【摘要】：目的：腸道病毒71型(enterovirus type 71, EV71)是人類手足口病的主要病原體。此外,還能引起無菌性腦膜炎,腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。迄今尚無有效的防治手段。VP1蛋白是EV71的主要衣殼蛋白,是病毒主要的中和抗原,它決定病毒的免疫原性。VPl基因具有與病毒血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性。不僅可作為腸道病毒屬內(nèi)不同血清型分類的依據(jù),而且可作為小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考。研究表明,蛋白質(zhì)有很強的免疫原性,免疫動物可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的抗體。通過提取病原體中具有免疫保護作用的蛋白,或利用DNA重組技術(shù)使重組體表達這類蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗,稱為亞單位疫苗。亞單位疫苗不含有感染性組分,無須滅活,也無致病性。自1981年成功地將口蹄疫病毒的VP3基因克隆到大腸埃希菌內(nèi)并制成用于牛和豬的疫苗之后,迄今已研制出包括乙型肝炎疫苗在內(nèi)的許多亞單位疫苗用于傳染病的預(yù)防。EV71感染患者的治療主要以對癥治療為主,缺乏特異、高效的抗病毒藥物。、目前,尚無公認的十分有效的預(yù)防疫苗。VPl蛋白是EV71的主要中和抗原,是疫苗研究的首選成分。本研究用原核表達系統(tǒng)中表達的EV71 VP1蛋白,免疫家兔,觀察免疫效果。 方法：1.從河北省疾病控制中心病毒病防治所提供的EV71C4亞基因型病毒臨床分離株提取核酸,用VP1基因的特異性引物進行RT-PCR擴增,將擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEM-T/VP1,轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌擴增,提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序篩選重組子。2.經(jīng)酶切鑒定和測序確認后,取雙酶切的VP1片段和經(jīng)過同樣兩種酶酶切的原核表達載體pET-his連接,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1。3.將原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1轉(zhuǎn)入表達宿主菌BL21(DE3)pLysS,誘導(dǎo)表達攜帶有6×HIS標簽的VP1蛋白,分別利用HIS單抗和EV71多抗經(jīng)Western-blot鑒定無誤后對目的蛋白進行優(yōu)化表達。將大量誘導(dǎo)表達后的菌體在冰浴中超聲破碎,分離上清和包涵體沉淀,對該蛋白的水溶性進行分析。將包涵體溶液進行SDS-PAGE,切下目的條帶,透析袋中透析。定量所得純化后的蛋白。4.動物實驗：選取重約2kg健康新西蘭白兔3只,用VP1蛋白背部皮下多點注射免疫,即于脊柱兩側(cè)選4～6點,共免疫3次,每次間隔2周。初次免疫每只注射劑量為600μg,加完全弗氏佐劑。加強免疫每只劑量為300μg,用不完全弗氏佐劑。末次免疫后15天,耳緣靜脈取血,分離血清,用腸道病毒71型抗體IgG診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)檢測血清抗體滴度。 結(jié)果：1.用RT-PCR方法從EV71提取的核酸中擴增出VP1基因片段,并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T/VP1,采用雙酶切和DNA測序證實此基因片段與報道的基因序列一致。2.成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1,雙酶切結(jié)果證實插入和連接均正確。3.在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中成功表達了EV71 VP1蛋白,表達蛋白主要以包涵體形式存在。Western-blot證實表達的蛋白可與HIS單抗和EV71多抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)。4.用VP1蛋白免疫家兔,免疫3次后,用腸道病毒71型抗體IgG診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法),檢測血清的抗體滴度,3只家兔血清抗體滴度分別為：1：81920：1：40960：1：40960。 結(jié)論：1.成功構(gòu)建了EV71VP1基因原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1。2.在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS成功表達了EV71VP1蛋白并進行初步純化。3.用純化的EV71 VP1蛋白免疫家兔能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大理學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：2307623