發(fā)布時間：2018-11-03 10:46

【摘要】： 近年來,人們對于免疫細胞亞群及其功能的認識大為拓展,特別是對于T細胞亞群的研究有了許多新的進展,除了以往廣泛公認的Th1、Th2之外,近年來對于調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、Thl7、Th9, Tfh等T細胞亞群的進一步區(qū)分與功能特征的研究以及與臨床疾病的聯(lián)系,使得人們對于免疫應(yīng)答與免疫調(diào)控的細胞與分子機制研究有了更深入的認識。此外,對于巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)的亞群、特別是M2和調(diào)節(jié)性DC亞群的研究也有了新的進展。但是,目前對于機體體液免疫中最關(guān)鍵的免疫細胞.---B細胞(B lymphocytes)的亞群及其相應(yīng)的功能特征的研究相比而言比較少。過去認為B細胞通過分泌抗體,在體液免疫系統(tǒng)中發(fā)揮“指揮家”的作用；B細胞還是一類重要的抗原提呈細胞,參與對抗原的攝取、加工、提呈,在啟動獲得性免疫應(yīng)答中起重要作用；此外,B細胞還可以通過分泌多種細胞因子和某些趨化因子以及表達某些重要膜分子,參與免疫應(yīng)答的調(diào)控�？梢�,B細胞具有功能多樣性,通過進一步研究B細胞的亞群組成及其功能特征,將有助于全面認識B細胞的功能和作用,從而對免疫應(yīng)答與調(diào)控的方式與機制增添新的學(xué)術(shù)觀點。 根據(jù)表面分子、定位和功能特點的不同,B細胞被分為B-1細胞和B-2細胞。B-2細胞即為傳統(tǒng)意義的B細胞。而B-1細胞主要在胚胎的胎肝、網(wǎng)膜中發(fā)育,分布于腹腔、胸腔和腸壁固有層中,又分為B-1a細胞(CD11b+CD5+)和B-1b細胞(CDllb+CD5-)。B-1細胞在IL-10幫助下保持自我更新能力,通過識別某些細菌表面共有的多糖抗原和一些變形的自身抗原,B-1a細胞及其分泌的自身抗體在幼兒的抗感染免疫中提供有效保護,而B-lb細胞在感染時則能對多糖和其他非T細胞依賴性的抗原產(chǎn)生長效的抗體應(yīng)答。近年來,人們發(fā)現(xiàn)了一類可以分泌IL-10的B細胞,根據(jù)其功能而將之稱為調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cell),作為一類新的B細胞亞群,其能夠調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答,大量的基礎(chǔ)研究和臨床證據(jù)表明,B細胞的功能具有明顯的異質(zhì)性,提示B細胞在免疫應(yīng)答被激活后可能分化為多個不同的功能亞群參與并調(diào)控免疫應(yīng)答,參與腫瘤、自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程,因此,有關(guān)新的B細胞亞群的發(fā)現(xiàn)與功能分析成為近年來免疫學(xué)研究的熱點之一。 由于天然免疫系統(tǒng)是機體抵御病原體入侵的第一道屏障,近年來已成為免疫學(xué)研究的重要領(lǐng)域,天然免疫應(yīng)答由NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和肥大細胞等天然免疫細胞介導(dǎo),通過模式識別受體識別細菌、真菌及病毒成分并活化,引發(fā)下游的多種免疫效應(yīng),但B細胞在其中的作用如何尚不明確。但一方面,B細胞能夠不依賴BCR信號介導(dǎo)而被活化；另一方面,由于B細胞能表達多種Toll樣受體(如TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)和其他的模式識別受體識別,那么病原體感染后微環(huán)境中存在的多種TLR配體及模式識別配體有可能能夠通過與B細胞上的受體交聯(lián),激發(fā)下游的信號傳遞,從而為B細胞參與天然免疫反應(yīng)以及隨后調(diào)控免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。 考慮到B細胞組成的異質(zhì)性以及B細胞參與天然免疫應(yīng)答和調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的多樣性功能特點,我們在本研究中分為三部分,研究了病原體感染或者病原體成分激活天然免疫反應(yīng)之后B細胞的亞群組成,以及我們所發(fā)現(xiàn)和鑒定的新型B細胞亞群的功能特點與相關(guān)作用機制,還對B細胞發(fā)育和功能分化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制進行了初步探討,以期為B細胞參與免疫應(yīng)答調(diào)控及其作用機制,以及其功能分化的分子機制增添新的認識。 一、CD19+DX5+B細胞亞群(NKB)的發(fā)現(xiàn)及其參與天然免疫、 調(diào)控獲得性免疫的作用與相關(guān)機制 為了探索B細胞在病原體感染后機體免疫應(yīng)答中的作用,我們對李斯特菌、大腸桿菌、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)感染的小鼠模型及TLR配體LPS、CpG-ODN、poly I:C注射的小鼠炎癥模型的各臟器B細胞采用流式細胞儀分析,發(fā)現(xiàn)了一群由病原體感染和TLR配體誘導(dǎo)增加的并廣泛分布于骨髓、脾臟、淋巴結(jié)組織中CD19+DX5+新型細胞亞群。為了進一步探索其特征,我們動態(tài)檢測了其產(chǎn)生過程,發(fā)現(xiàn)脾臟中CD19+DX5+雙陽性細胞在細菌感染后第3天數(shù)量開始顯著上升,到第7天達到峰值,其后逐漸下降,直至感染后第17-21天恢復(fù)至初始水平；而在LPS、CpG-ODN、polyI:C體內(nèi)注射所誘導(dǎo)的小鼠模型中,CD19+DX5+細胞數(shù)量于刺激后第5天達高峰,隨后下降；結(jié)果表明,該細胞亞群可被病原體感染或者病原體組分刺激所誘導(dǎo)產(chǎn)生,提示其可能會參與或者調(diào)控機體抗感染的天然免疫及獲得性免疫應(yīng)答。 流式分析發(fā)現(xiàn)CD19+DX5+雙陽性細胞表面表達NK及B細胞的相關(guān)表面標(biāo)志,包括mIgD、mIgM、B220、IA-e、CD40、CD 154、CD86、Ly49A、Ly49C/I、Ly49D、NKG2D、NKG2A/C/E、CD43、CD25、CD122、CD 11b等。電鏡下CD19+DX5+雙陽性細胞染色質(zhì)疏松,胞漿富含線粒體和高爾基體。胞內(nèi)染色及ELISA結(jié)果顯示其分泌IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、Granzyme-B,而不分泌Th2型細胞因子IL-4和IL-10。此外,由于該細胞具有B細胞的表面標(biāo)志,我們檢測其免疫球蛋白分泌,發(fā)現(xiàn)該細胞在LPS刺激后可以分泌IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM,采用李斯特菌感染B細胞缺陷Btk-/-小鼠及NK細胞剔除小鼠證明體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的該細胞亞群來源于B細胞而非NK細胞,由此推測CD19+DX5+細胞是一個具有NK樣表型和分泌細胞因子特征的B淋巴細胞亞群(我們簡稱NKB)。 我們在體外將DX5-CD19+B細胞分別與純化的CD4+或CD8+T細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞進行共培養(yǎng),并加入LPS刺激,發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞可以誘導(dǎo)DX5+CD19+NKB細胞的產(chǎn)生。為進一步明確其產(chǎn)生機制,我們在共培養(yǎng)體系中分別采用0.4μM transwell或者加入抗IL-6、IL-1β、IL-12、CD40、CD40L的單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞可以通過CD40-CD40L途徑誘導(dǎo)NKB細胞產(chǎn)生,且其分泌的IL-6和IL-1β對這一過程有促進作用,李斯特菌感染的CD 11 c-DTR、Cd40-/-、Cd401-/小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果進一步證實了一旦缺失了樹突狀細胞、CD40-CD40L相互作用,NKB細胞將不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生；而在李斯特菌感染僅能在I11r-/-及I16-/-小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生少量NKB細胞。證明了NKB的產(chǎn)生需要樹突狀細胞通過CD40-CD40L與B細胞前體相互作用,IL-6和IL-1β對這一誘導(dǎo)過程有促進作用。 接下來我們研究了NKB細胞在細菌感染天然免疫應(yīng)答的作用,發(fā)現(xiàn)NKB細胞通過分泌的IFN-γ活化巨噬細胞,可以增強其對胞內(nèi)菌的殺傷,抑制李斯特菌在胞內(nèi)的數(shù)量增長；體內(nèi)回輸NKB細胞也顯著降低李斯特菌感染早期的肝脾細菌負荷并上調(diào)血清IFN-γ水平,但回輸Ifnγ-/-NKB細胞則無類似效應(yīng)。說明NKB細胞能通過其分泌的IFN-γ激活巨噬細胞,參與細菌感染早期的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。 由于NKB細胞數(shù)量高峰出現(xiàn)于感染第7天,因此我們對C57BL／6小鼠回輸CD45.1+OT-I CD8+T細胞,然后感染能分泌OVA的李斯特菌株(LM-OVA),旨在研究NKB細胞在獲得性免疫應(yīng)答的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與感染后第7天的NKB細胞共培養(yǎng)可以促進李斯特菌感染小鼠抗原特異性CD8+T細胞的凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)NKB細胞來源的IFN-γ能上調(diào)其本身表達FasL及OT-I CD8+T細胞Fas的表達,旦阻斷IFN-γ或Fas-FasL信號,則NKB細胞誘導(dǎo)CD8+T細胞的凋亡比例降低。我們在LM-OVA感染Btk-／-小鼠前后分別回輸CD45.1+OT-I CD8+T細胞與NKB細胞、NK細胞或B細胞,發(fā)現(xiàn)細菌感染7天后NKB細胞回輸組CD8+T細胞數(shù)量較與NK細胞或B細胞回輸組顯著下降,但CD8+T細胞表面活化標(biāo)志CD44.CD62L.CD69較對照組表達無顯著變化。采用CFSE標(biāo)記的OT-I CD8+T細胞與NKB細胞共同回輸并檢測李斯特菌感染3天后T細胞增殖,結(jié)果表明OT-I CD8+T細胞增殖并無差異,結(jié)果表明,NKB細胞在體內(nèi)不顯著影響抗原特異性CD8+T細胞產(chǎn)生。若采用Ifnγ-/-或Fasl-/-小鼠NKB細胞與OT-ⅠCD8+T細胞共同回輸,對OT-IT細胞的數(shù)量及活化并無影響。因此,于感染第7天大量誘導(dǎo)產(chǎn)生的NKB細胞通過IFN-γ和Fas-FasL通路可以促進抗原特異性CD8+T細胞凋亡,使得抗原特異性獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)受到適度的負相調(diào)控,從而利于維持免疫應(yīng)答的穩(wěn)定性�？梢�,我們發(fā)現(xiàn)的這群由病原體感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD19+DX5+NKB細胞在天然免疫應(yīng)答的早期通過IFN-γ激活巨噬細胞而起促進作用,發(fā)揮了NK細胞樣的天然免疫效應(yīng)細胞的作用；但在獲得性免疫應(yīng)答的晚期大量產(chǎn)生之后,其通過IFN-γ和Fas-FasL通路誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細胞凋亡而對免疫應(yīng)答反應(yīng)起負相調(diào)控作用,發(fā)揮了調(diào)節(jié)性B細胞樣的作用,表明該新型B細胞亞群具有獨特的雙重免疫功能,即被病原體感染誘導(dǎo)產(chǎn)生之后反饋促進天然免疫誘導(dǎo)以利于機體清除病原體,但另外一方面,通過負相調(diào)控抗原特異性CD8+T細胞應(yīng)答反應(yīng)以利于免疫應(yīng)答處于平衡狀態(tài),從而避免免疫應(yīng)答過度活化之后造成機體病理學(xué)損害。 二、CD19+PDCA-1+B細胞亞群的發(fā)現(xiàn)及其參與天然免疫功能 與機制的研究 我們在實驗中發(fā)現(xiàn)Btk-／-小鼠對李斯特菌感染相比野生型小鼠具有較高易感性,在感染早期的肝臟和脾臟細菌增殖更活躍,且血清IFN-γ水平低下,提示B細胞在抗御李斯特菌感染中起重要作用。為了明確B細胞在抗感染天然免疫應(yīng)答中的功能,我們在李斯特菌及大腸桿菌體內(nèi)感染48小時后的C57BL／6小鼠脾臟細胞的B細胞及其亞群進行了分析,發(fā)現(xiàn)了一群廣泛分布于骨髓、脾臟、淋巴結(jié)的CD19+PDCA-1+雙陽性細胞,在感染后48小時達高峰,隨后逐漸降低,至第八天達到感染前水平,提示該細胞可能直接參與機體的天然免疫應(yīng)答過程。 共聚焦顯微鏡及H-E染色后觀察結(jié)果顯示,CD19+PDCA-1+雙陽性細胞直徑6-8μM,呈圓形,表面光滑,細胞質(zhì)稀少,細胞核致密,具有典型的B淋巴細胞形態(tài)特征；膜表面表達mIgM.mIgD.B220.CD23等B細胞特異性分子；胞內(nèi)表達Thl型細胞因子IL-12p40、TNF-α、IL-1α、IL-6,并在HKLM刺激后高分泌IFN-α。綜合以上特征,我們認為CD19+PDCA-1+雙陽性細胞是一群獨特的具有Ⅰ型干擾素分泌能力的新型B淋巴細胞亞群。 采用體外細胞共培養(yǎng),我們證明在熱滅活的李斯特菌(Heat-killed L. monocytogenes)刺激下,巨噬細胞能夠誘導(dǎo)CD19+PDCA-1-細胞向CD19+PDCA-1+細胞分化；究其機制,我們在共培養(yǎng)體系中分別采用0.4μM transwell各兩者隔離開,或者加入CD40、CD40L、IFN-γ阻斷性抗體以及相應(yīng)重組細胞因子,發(fā)現(xiàn)CD19+ PDCA-1+細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著減少。此外,我們在李斯特菌感染的Cd40-/-、Cd401-/-小鼠體內(nèi)也無法檢測到CD19+ PDCA-1+細胞的產(chǎn)生,而在相應(yīng)的Ifnγ-/-小鼠模型中也檢測到了PDCA-1+ B細胞比例顯著下降。結(jié)果表明,巨噬細胞誘導(dǎo)PDCA-1+CD19+細胞的產(chǎn)生是由IFN-γ和CD40-CD40L信號介導(dǎo)的。 根據(jù)PDCA-1+B細胞的產(chǎn)生特點以及B細胞缺陷的Btk-/-小鼠在早期對李斯特菌感染的高易感性,我們認為這群PDCA-1+B細胞是參與機體抗感染天然免疫應(yīng)答的B細胞亞群。體外實驗證實PDCA-1+B細胞對李斯特菌在巨噬細胞內(nèi)增殖并無顯著直接影響。已知NK細胞活化和分泌大量IFN-γ對于李斯特菌體內(nèi)清除其重要作用,為了觀察PDCA-1+B細胞對李斯特菌體內(nèi)清除的影響,我們將其與NK細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)PDCA-1+B細胞能通過分泌IFN-a促進NK細胞活化,殺傷Yac-1細胞,并分泌IFN-γ。對李斯特菌感染的Btk-/-小鼠回輸PDCA-1+B細胞能有效降低臟器中的細菌負荷并上調(diào)外周血IFN-γ水平；但若用純化的PK136抗體將NK細胞剔除后,回輸PDCA-1+B細胞對李斯特菌感染的Btk-/-小鼠的保護作用消失,且回輸Ifnγ-/-鼠來源的NK細胞也無法恢復(fù)PDCA-1+B細胞對李斯特菌感染時對機體的保護效應(yīng)。 因此，，我們通過體內(nèi)外實驗證實,由病原體感染所誘導(dǎo)產(chǎn)生的PDCA-1+B細胞能在李斯特菌感染早期通過其分泌的IFN-a激活NK細胞并促進其IFN-γ的分泌,從而參與機體天然免疫應(yīng)答,利于機體清除入侵的病原體。本研究為B細胞直接參與抗感染免疫應(yīng)答提供了新的實驗依據(jù),也為全面認識B細胞亞群的非經(jīng)典的生物學(xué)功能提出了新的研究方向。 三、轉(zhuǎn)錄因子Foxpl對B細胞功能調(diào)控作用的初步探討 研究表明,轉(zhuǎn)錄因子對于免疫細胞的分化發(fā)育起決定性作用。Foxp亞家族(Foxpl,Foxp2,Foxp3)的功能及調(diào)控機制研究已成為近年來人們的研究熱點。Foxpl從小鼠B淋巴瘤細胞系BCL1中被首次發(fā)現(xiàn)和克隆至今已逾十年,但有關(guān)它在免疫細胞發(fā)育分化過程中的作用及相關(guān)機制的研究卻剛剛起步。近年來,Foxpl對B細胞、T細胞、單核巨噬細胞的發(fā)育分化乃和功能調(diào)控的作用陸續(xù)被人們提出并證實,這一系列的發(fā)現(xiàn)令Foxpl這一重要轉(zhuǎn)錄因子在免疫細胞分化發(fā)育及功能調(diào)控中的作用與機制研究越來越受到關(guān)注。 為探索B細胞及其亞群的發(fā)育及功能分化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制,我們初步探討了在LPS刺激或病原體感染后Foxpl對B細胞的功能影響。我們發(fā)現(xiàn)Foxpl表達廣泛,在心臟、腦、肺、肝、腎、胸腺、脾、腋窩淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和骨髓中均有表達,其中心、腦、肺、胸腺、脾臟、腋窩和腸系膜淋巴結(jié)中Foxp1表達較高。我們進一步鑒定了本室引進的Foxp1基因敲除小鼠(Foxp1-/-)B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和巨噬細胞中Foxp1蛋白表達較野生型Foxp1+／+小鼠的相應(yīng)免疫細胞的表達水平下調(diào)80%-90%。我們對Foxp1-/-小鼠的B細胞功能進行了初步分析,研究發(fā)現(xiàn),無論是LPS體外刺激還是李斯特菌體內(nèi)感染,Foxp1-/-B細胞的IL-10分泌均顯著下調(diào)；另一方面,在LPS刺激后Foxp1-/小鼠中B細胞的炎性因子IL-6、IFN-α、IFN-γ較野生型小鼠B細胞分泌量上升,但對李斯特菌體內(nèi)感染的B細胞的細胞因子mRNA表達水平進行分析,我們并未獲得同樣結(jié)果,IL-6、IFN-a表達較野生型小鼠并無顯著變化,但IFN-γ的mRNA表達水平卻顯著下調(diào)。由此我們推測,Foxp1對B細胞負向免疫調(diào)控功能可能具有潛在的誘導(dǎo)作用；而Foxp1對B細胞炎性因子分泌的影響以及對B細胞抗感染免疫應(yīng)答功能的調(diào)控作用尚不明確,需要我們設(shè)計實驗進行深入探討。 四、總結(jié) 在第一部分實驗中,發(fā)現(xiàn)并鑒定了一群具有NK細胞樣特征、能夠分泌IFN-γ的DX5+ CD19+ B細胞,稱為NKB細胞亞群。NKB細胞能在免疫應(yīng)答早期(李斯特菌感染3天內(nèi)天然免疫階段)通過分泌IFN-γ激活巨噬細胞、促進其對胞內(nèi)菌的清除,發(fā)揮了NK細胞樣的功能；NKB細胞能在免疫應(yīng)答晚期(李斯特菌感染7天獲得性免疫階段)通過分泌的IFN-γ上調(diào)自身FasL及抗原特異性CD8+T細胞表面Fas的表達,從而誘導(dǎo)CD8+T細胞凋亡,從而發(fā)揮了調(diào)節(jié)性B細胞的功能,適度控制了獲得性免疫應(yīng)答的強度,從而使得抗原特異性T細胞應(yīng)答反應(yīng)受到適度的負相調(diào)控,有助于維持免疫應(yīng)答的穩(wěn)定性�？梢�,該病原體感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的新型NKB細胞亞群具有NK細胞的天然免疫應(yīng)答效應(yīng)和調(diào)節(jié)性B細胞的負相免疫調(diào)控功能,其分泌的IFN-γ在介導(dǎo)其雙重功能中起重要的作用。新型B細胞亞群(DX5+ CD19+ NKB)的發(fā)現(xiàn)與初步揭示的其功能特點,為天然免疫的效應(yīng)機制增添了新的學(xué)術(shù)觀點,也豐富了人們對調(diào)節(jié)性B細胞的負向調(diào)控功能及機制的認識,并為獲得性免疫負向調(diào)控提出了新機制。 在第二部分實驗中,發(fā)現(xiàn)并鑒定了一群能分泌IFN-α的CD19+ PDCA-1+ B細胞,該新型B細胞亞群能通過分泌的IFN-α而激活NK細胞并促進其分泌IFN-γ,從而參與、促進了胞內(nèi)菌感染早期的天然免疫應(yīng)答過程。此外,我們的研究結(jié)果證明,IFN-α能正反饋調(diào)節(jié)IFN-γ信號通路,這一發(fā)現(xiàn)為病原體入侵機體后天然免疫應(yīng)答的快速啟動及蛋白調(diào)控提出了新機制,也為B細胞的天然免疫功能增添了新的認識。 在第三部分實驗中,我們對B細胞及其亞群的發(fā)育及功能分化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制進行了初步探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在LPS體外刺激和李斯特菌體內(nèi)感染后轉(zhuǎn)錄因子Foxp1的表達均能促進B細胞分泌IL-10,但其炎性因子分泌變化趨勢并不相同,我們推測Foxp1對B細胞負向免疫調(diào)控功能可能具有潛在的誘導(dǎo)作用,而其對B細胞抗感染免疫應(yīng)答的調(diào)控作用以及在B細胞亞群產(chǎn)生和功能中作用尚不明確,需要將來開展進一步實驗深入探討。 總之,深入研究B細胞及其亞群在不同感染模型中的功能及其機制將有助于我們進一步了解B細胞在機體受到外來病原體或者異源抗原刺激后免疫應(yīng)答的啟動、維持和調(diào)控中的作用,更加全面認識機體復(fù)雜而平衡的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并為免疫細胞亞群認識的拓展及感染性疾病的免疫治療提供新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【引證文獻】

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1 孫雪;曾浪;孫卓;李翠英;;調(diào)節(jié)性B細胞在慢性炎癥疾病及自身免疫疾病的作用機制[J];遼寧醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

本文編號：2307560