【摘要】： 隨著免疫識別理論、分子生物學(xué)知識和電子顯微技術(shù)的不斷進(jìn)展與突破,大量研究證實(shí)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞對于抗原的識別是與MHC分子結(jié)合遞呈的抗原短肽。有效的抗原表位肽可以通過樹突細(xì)胞呈遞到MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ途徑引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。近年來又有科學(xué)家提出復(fù)合表位或改構(gòu)表位可以增強(qiáng)單表位的功能。隨著DC疫苗在臨床的應(yīng)用及其相關(guān)研究的進(jìn)一步深入,尋找有效的T細(xì)胞表位以增強(qiáng)DC疫苗在抗腫瘤及治療感染性疾病的作用受到越來越多的重視。如何使外來抗原通過MHC-Ⅰ途徑誘發(fā)CD8+CTL反應(yīng)是DC在臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵。 該課題的設(shè)計(jì)主要針對病因明確的病毒性疾病,擬選擇以乙型肝炎病毒源性肝炎為疾病模型,以細(xì)胞免疫所攻擊的乙型肝炎病毒核心蛋白為靶蛋白,通過軟件預(yù)測的方法分析該蛋白的生物學(xué)特性及T細(xì)胞表位肽,將設(shè)計(jì)得到的表位修飾并合成。建立可標(biāo)準(zhǔn)化的DC培養(yǎng)平臺;通過實(shí)驗(yàn)探討表位肽對DC功能的影響以及其作用機(jī)理,為DC在臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分為四部分,具體如下: 第一部分T細(xì)胞表位肽的設(shè)計(jì)與篩選 目的預(yù)測HBV核心蛋白的一般生物學(xué)特性及該蛋白片段上有效的HLA-2限制性CTL表位。方法從Genebank中選擇B型(adw) HBV的核心蛋白,用軟件CLC Protein Workbench3版本和SignalP3.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)對HBV核心抗原的編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測的一般生物學(xué)特性;采用SYFPEITHI遠(yuǎn)程預(yù)測數(shù)據(jù)庫、PREDEPP數(shù)據(jù)庫、基序法和多項(xiàng)式法共同對HBV核心抗原編碼蛋白進(jìn)行HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測。結(jié)果通過軟件對HBV核心蛋白進(jìn)行分析,明確了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū),信號肽,亞細(xì)胞定位,抗原性位點(diǎn)。篩選了5條T細(xì)胞表位肽。結(jié)論預(yù)測方案的聯(lián)合使用可以提高T細(xì)胞表位肽篩選的準(zhǔn)確率。 第二部分T細(xì)胞表位肽的鑒定、修飾與合成 目的鑒定篩選出的5條肽生物學(xué)特性,修飾并合成與抗原結(jié)合性能最好的肽,為進(jìn)一步探討外源性小分子表位肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激發(fā)MHC1類反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。方法用抗原性能結(jié)合實(shí)驗(yàn)分別從親和力、結(jié)合穩(wěn)定性和MHC-肽復(fù)合體穩(wěn)定性三方面鑒定5條表位肽與抗原的結(jié)合性能,篩選出結(jié)合性能最好的兩條肽,并用輔助性T細(xì)胞表位、B細(xì)胞表位和棕櫚�；揎�,Fmoc方案合成。結(jié)果篩選出2條T細(xì)胞表位肽,合成9條肽,構(gòu)成11組表位肽。結(jié)論利用抗原結(jié)合性能實(shí)驗(yàn)和Fmoc合成方案可以完成抗原肽的鑒定與合成。 第三部分人外周血單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)化平臺的搭建 目的建立一種可標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模操作DC培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化及鑒定平臺。方法將人外周血的PBMC用CD14+磁珠標(biāo)記,在磁場中分離出CD14+PBMC;將分選得到的細(xì)胞在DC培養(yǎng)袋中加入IL-4,GM-CSF共培養(yǎng),第10天,收集細(xì)胞計(jì)數(shù),Typanlan染色觀察活性,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型,掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果光學(xué)顯微鏡下,樹突狀細(xì)胞懸浮生長,大小不等,形態(tài)極不規(guī)則,向四周伸出不同數(shù)量的粗細(xì)不一、形態(tài)迥異的胞質(zhì)突起。CD14+PBMC在初始血液中的比例為14%,而經(jīng)過分離純化后的CD14+細(xì)胞的濃度達(dá)到94.8%。在培養(yǎng)10天后的細(xì)胞懸液中,由于大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化為DC,所以分子表面標(biāo)志發(fā)生改變,CD14+細(xì)胞的濃度僅為0.65%;在培養(yǎng)出的DC細(xì)胞表面高表達(dá)HLA-I(70.43%),HLA-Dr(0.65%),CD80(89.45% ),CD86(86.32%),部分表達(dá)CD40(29.61%)。這些細(xì)胞表面分子標(biāo)志都是人PBMC轉(zhuǎn)化為DC后的特征性分子。掃描電鏡可見被固定的樹突狀細(xì)胞仍保持其特征性的突起,使細(xì)胞呈星狀、多角形或極不規(guī)則形。突起長短不一,分支形成1-4級的亞突起。結(jié)論從PBMC中分離純化的CD14+細(xì)胞通過加入細(xì)胞因子可以在細(xì)胞培養(yǎng)袋中非貼壁式培養(yǎng)出高純度的DC。 第四部分DC介導(dǎo)的靶向性殺傷功能及機(jī)制的初步探討 目的對比負(fù)載不同表位肽的DC的生物學(xué)功能篩選出殺傷功能最佳的表位肽組合,從微分子水平探討組合肽的功能性差異。方法用四噻唑藍(lán)法實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒功能;ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測負(fù)載不同表位的DC刺激T細(xì)胞分泌γ-IFN的功能;原子力顯微鏡分析DC經(jīng)小分子肽作用后表面精細(xì)結(jié)構(gòu)改變;激光共聚焦顯微鏡分析小分子肽進(jìn)入細(xì)胞后不同時(shí)間的表現(xiàn);免疫熒光顯微鏡觀察DC攝取肽的過程。結(jié)果細(xì)胞經(jīng)第T1,T1+T2,T1+Th,T1-AAA-Th,pal-KSST1,pal-KSST1AAATh,T1+B,pal-KSST1Th,T1+Th,B組短肽處理后,細(xì)胞活性較對照組有顯著性升高(p0.05),其中第T1+B組肽則可使細(xì)胞活性呈現(xiàn)極顯著升高(p0.01),而經(jīng)T2,Th,T1Th短肽處理后,細(xì)胞活性較對照組有顯著性降低(p0.05),其中第T2組肽使細(xì)胞活性呈現(xiàn)極顯著降低。篩選出的表位肽T1可以上調(diào)DC對T細(xì)胞刺激能力(P0.01),而經(jīng)過棕櫚酰絲氨酸修飾的表位或B細(xì)胞、Th協(xié)同的T細(xì)胞表位負(fù)載DC刺激能力也有同樣表現(xiàn)(P0.01),無論輔助性T細(xì)胞表位還是B細(xì)胞表位對于T1均有協(xié)同作用。將輔助性T細(xì)胞表位直接偶聯(lián)到T1表位上,破壞了T1刺激DC的能力。即使在T1表位和Th內(nèi)部通過AAA連接,并以棕櫚酰絲氨酸修飾也不會表現(xiàn)出比單獨(dú)的T1表位明顯的功能增強(qiáng)。激光共聚焦的結(jié)果顯示小分子肽可以在30分鐘被DC快速攝取,免疫熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)肽的攝取是在5min內(nèi)完成的;小分子肽的攝取由胞體完成后向樹突傳遞,而且樹突的肽濃度相對胞體較低。小分子肽被細(xì)胞攝取后的12h內(nèi),始終不曾進(jìn)入細(xì)胞核。在透射電鏡下,負(fù)載肽的DC線粒體增大,增多,核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。而MTT活性檢測實(shí)驗(yàn)顯示這些被肽激活的DC的功能上調(diào)。結(jié)論DC經(jīng)不同短肽處理后,細(xì)胞活性會產(chǎn)生一定程度的改變。短肽使T淋巴細(xì)胞的殺傷活性增高的原因主要是通過DC激活了細(xì)胞免疫途徑,發(fā)揮了CTL效應(yīng)。棕櫚�；揎椇罂梢陨险{(diào)T細(xì)胞表位的功能;B細(xì)胞表位和Th可以通過表位間的協(xié)同作用增強(qiáng)T細(xì)胞表位肽激活CTL的效應(yīng)。AFM觀察到細(xì)胞表面形貌變化受外源性小分子肽一級結(jié)構(gòu)的影響,而且直接影響細(xì)胞的活性。小分子肽不作為遺傳物質(zhì)參與細(xì)胞的信息傳遞,這一現(xiàn)象為表位肽作為疫苗,與DC共培養(yǎng)后回輸機(jī)體的安全性提供了理論基礎(chǔ)。 研究發(fā)現(xiàn)軟件預(yù)測是一種可行的T細(xì)胞表位肽篩選方案,極大的縮減了實(shí)驗(yàn)的工作量,不同類別的表位肽之間的協(xié)同作用對于上調(diào)DC的生物學(xué)功能大于表位間的偶聯(lián)效應(yīng)。棕櫚�；砦浑囊部梢陨险{(diào)DC對于T細(xì)胞的刺激能力。不同的小分子肽對DC表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響不一樣,產(chǎn)生的CTL殺傷效應(yīng)也不同。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃偉峰,郝飛,刁慶春,鐘白玉;HPV16 E7多肽沖擊的樹突狀細(xì)胞治療尖銳濕疣的臨床初步觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年15期

2 楊朝暉,錢起豐,吳志華;尖銳濕疣患者自然殺傷細(xì)胞活性及其與血清白介素-12關(guān)系的研究[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年03期

3 韋嘉,姚集魯;細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)與病毒性肝炎[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);1999年12期

4 黃健;HLA超型與表位肽超基序及其理論與現(xiàn)實(shí)意義[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2001年06期

5 潘]q,郭曉楠,董作仁;白細(xì)胞介素_(12)與腫瘤免疫[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年06期

6 王少揚(yáng),林玉梅,馬衛(wèi)閩,戚少然,蘭鳳華;IL-12對慢性乙型肝炎患者T_(H1)/T_(H2)分化的影響[J];免疫學(xué)雜志;2001年06期

7 支軼,吳玉章,萬瑛;生物信息學(xué)方法在CTL表位預(yù)測中的應(yīng)用[J];免疫學(xué)雜志;2005年02期

8 林治華,吳玉章;計(jì)算機(jī)輔助T細(xì)胞表位鑒定[J];生命的化學(xué);2004年05期

9 傅晉翔,劉艷,梁建英;臍血CD34~+細(xì)胞體外擴(kuò)增及樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用腫瘤雜志;2001年04期

10 成軍,李莉;清除乙型肝炎病毒的非細(xì)胞裂解機(jī)制[J];世界華人消化雜志;2002年01期

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本文編號：2302927