【摘要】： 含硒谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是機體內(nèi)最重要的抗氧化酶,已有許多GPX的人工模擬酶,但活力普遍不高。對已有的GPX模擬酶進行深入研究表明,產(chǎn)生底物結(jié)合位點是制備高活力GPX模擬酶的關(guān)鍵因素之一。單克隆抗體(McAb)制備技術(shù)是產(chǎn)生具有底物結(jié)合部位受體的有效手段。羅貴民小組在制備模擬GPX抗體酶的過程中,提出了疏水修飾理論并應用該理論制備了一系列具有較高GPX活力的單克隆抗體酶,在此基礎(chǔ)上又應用基因工程方法制備了模擬GPX的小分子單鏈抗體(scFv)酶。這些抗體酶雖然活性較高,但來源于鼠的免疫原性限制了它們的醫(yī)學應用。本研究的主要目的就是制備具有一定GPX活力的人源單鏈抗體酶,并在細胞水平上研究其抗氧化作用。主要開展了以下工作: 1.合成抗原GSH-S-DNPBu 根據(jù)羅貴民小組提出的疏水修飾理論合成了谷胱甘肽(GSH)的類似物GSH-S-DNPBu,用核磁共振對合成的化合物進行了分析。 2.親和篩選抗GSH-S-DNPBu的噬菌體單鏈抗體 通過吸附-洗脫-擴增步驟,從噬菌體展示人源單鏈抗體庫(human synthetic VH+VL scFv library)中親和篩選抗GSH-S-DNPBu的噬菌體單鏈抗體。用“多克隆噬菌體ELISA”監(jiān)測篩選過程并用“單克隆噬菌體ELISA”選擇可以和GSH-S-DNPBu特異性結(jié)合的單克隆噬菌體。 3.表達和純化人源單鏈抗體 根據(jù)“單克隆噬菌體ELISA”結(jié)果,提取選擇的單克隆噬菌體DNA,應用PCR方法從噬菌體DNA中擴增出編碼人源單鏈抗體的基因,將其克隆到分泌性表達載體pPELB中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta,誘導轉(zhuǎn)化菌Rosetta表達人源單鏈抗體。用Ni2+螯合親和層析(IMAC)純化可溶性表達的人源單鏈抗體。應用SDS-PAGE和western blot實驗鑒定表達和純化的人源單鏈抗體。 4.制備人源含硒單鏈抗體酶 用化學突變法將人源單鏈抗體中的絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槲腚装彼?Sec),得到具有GPX活力的人源含硒單鏈抗體酶,其活力為1288 U/μmol。 5.在細胞水平上研究人源含硒單鏈抗體酶的抗氧化作用 利用H2O2損傷大鼠乳鼠的心肌細胞建立氧化應激損傷模型,應用MTT法,丙二醛(MDA)測定試劑盒,乳酸脫氫酶(LDH-L)比色法試劑盒,流式細胞儀和活性氧測定試劑盒檢測受損細胞的存活率、脂質(zhì)過氧化程度、心肌細胞膜完整性、線粒體膜電位和細胞內(nèi)ROS水平等指標的變化以及人源含硒單鏈抗體酶對上述指標的影響。結(jié)果表明人源含硒單鏈抗體酶能部分的增加心肌細胞存活率,減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成,降低由于細胞膜完整性受損而引起的LDH泄漏,恢復線粒體膜電位,降低細胞內(nèi)ROS含量,表明人源含硒單鏈抗體酶具有很強的抗氧化能力和良好的藥用前景。
[Abstract]:Se-containing glutathione peroxidase (GPX) is the most important antioxidant enzyme in the body. There are many artificial mimic enzymes of GPX, but the activity is generally low. A thorough study of the existing GPX mimics showed that the production of substrate binding sites was one of the key factors for the preparation of highly active GPX mimics. The preparation of monoclonal antibody (McAb) is an effective method to produce substrate-binding receptor. In the process of preparing mimic GPX antibody enzyme, Luo Guimin team proposed hydrophobic modification theory and used the theory to prepare a series of monoclonal antibody enzymes with high GPX activity. On the basis of this, the small molecular single chain antibody (scFv) enzyme mimicking GPX was prepared by genetic engineering method. Although the activity of these antibody enzymes is high, the immunogenicity of these antibodies from mice limits their medical application. The main purpose of this study was to prepare human scFv with GPX activity and to study its antioxidant activity at cellular level. The main work is as follows: 1. The synthesis of glutathione (GSH) analogues based on hydrophobic modification theory proposed by Luo Guimin's group was studied by synthetic antigen GSH-S-DNPBu. The synthesized compounds were analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR). 2. The phage scFv against GSH-S-DNPBu was screened by affinity screening by adsorption-elution amplification step. The phage scFv against GSH-S-DNPBu was screened by affinity from phage display human scFv library (human synthetic VH VL scFv library). The screening process was monitored by "polyclonal phage ELISA" and "monoclonal phage ELISA" was used to select the monoclonal phage that could specifically bind to GSH-S-DNPBu. 3. Expression and purification of human single-chain antibody based on the results of "Monoclonal phage ELISA", the selected monoclonal phage DNA, was used to amplify the gene encoding human single-chain antibody from phage DNA by PCR method. It was cloned into secretory expression vector pPELB and transformed into Escherichia coli Rosetta, to induce Rosetta to express human scFv. Soluble human scFv was purified by Ni2 chelating affinity chromatography (IMAC). The expressed and purified human scFv was identified by SDS-PAGE and western blot experiments. 4. Preparation of human Se-containing scFv enzyme conversion of serine from human scFv to selenocysteine (Sec), by chemical mutation method to obtain a human Se-containing scFv with GPX activity, the activity of which is 1288 U / 渭 mol. 5. Study on the Antioxidant effect of Human Se-containing single chain Antibody enzyme at the Cell level the oxidative stress injury model of neonatal rat cardiomyocytes damaged by H2O2 was established. The MTT assay and malondialdehyde (MDA) assay kit were used to detect the oxidative stress. Lactate dehydrogenase (LDH-L) colorimetric kit, flow cytometry and reactive oxygen species assay kit were used to detect the survival rate, lipid peroxidation and integrity of myocardial cell membrane. The changes of mitochondrial membrane potential and intracellular ROS level and the effect of human selenium single chain antibody enzyme on these indexes. The results showed that human scFv could partially increase the survival rate of myocardial cells, reduce the production of lipid peroxidation product MDA, reduce the leakage of LDH caused by the damage of cell membrane integrity, and restore mitochondrial membrane potential. The decrease of ROS content in cells indicates that human scFv has strong antioxidant ability and good medicinal prospect.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R341

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