【摘要】： 前言 目前,干細(xì)胞移植已經(jīng)成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system,CNS)損傷特別是脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后功能恢復(fù)研究的熱點。適合進(jìn)行移植的細(xì)胞有成體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cells,ESCs)以及嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)、雪旺氏細(xì)胞(schwann cells,SCs)等。主要機理在于,移植的細(xì)胞可以在CNS的神經(jīng)組織內(nèi)長期存活,分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、改善損傷區(qū)局部微環(huán)境,替代變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞,從而促進(jìn)受損傷神經(jīng)細(xì)胞軸突生長,其中ESCs取材困難、且涉及免疫排斥和倫理道德等問題;而MSCs來源豐富、取材方便、適合自體移植而不受倫理約束、且沒有免疫排斥反應(yīng),具有高度自我更新和多向分化能力,故被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)研究。 MSCs可以分離自諸多成體組織如骨髓、脂肪、臍血等。體外研究表明,MSCs在一定條件下可分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞,表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物,如β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP2)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神經(jīng)元核蛋白(neuron nuclear-protein,NeuN)等。但迄今為止,不同來源的MSCs是否具有不同的分化能力尚無定論。本實驗以同屬MSCs的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)和脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stromalcells,ADSCs)為主要研究對象,比較分析了這兩種細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的潛力,旨在為干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)提供新的實驗數(shù)據(jù)。 第一部分ADSCs和BMSCs的取材與傳代培養(yǎng) 目的建立獲取、傳代培養(yǎng)及初步鑒定大鼠ADSCs和BMSCs的技術(shù)體系,為下一步誘導(dǎo)分化及其比較實驗研究奠定基礎(chǔ)。 方法1.ADSCs的取材、傳代采用酶消化法分離ADSCs。主要步驟:無菌麻醉條件下取SD成年大鼠的腹部脂肪組織,剪碎后用2.5%的Ⅰ型膠原酶37℃條件下消化60min;之后1200rpm離心8min,棄去上層的脂肪和中問的液體,將底部的細(xì)胞重懸、以1200rpm離心8min后棄去上清,加入5ml含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,吹打均勻后接種于底面積25cm~2的一次性培養(yǎng)瓶中,置5%CO_2、37℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每周換液2次。貼壁細(xì)胞達(dá)到90%融合時按1:3傳代。共傳5代以后進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。 2.BMSCs的取材、傳代采用全骨髓培養(yǎng)的方法分離BMSCs。主要步驟:無菌麻醉條件下取同一只成年SD大鼠的股骨和脛骨,用DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔,獲得的細(xì)胞懸液經(jīng)1000rpm離心8min后棄去上清,加入5ml含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,吹打均勻后接種于底面積25cm~2的一次性培養(yǎng)瓶中,置5%CO_2、37℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2d后棄去未貼壁細(xì)胞;每周換液2次。貼壁細(xì)胞達(dá)到90%融合時按1:3傳代。共傳5代以后進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。 3.干細(xì)胞特征檢測:以CD44為一抗對原代細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。以CD29、CD34、CD44、CD90為細(xì)胞表型對第5代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,分別確定ADSCs和BMSCs的干細(xì)胞特征。 結(jié)果原代BMSCs于2d后貼壁,7d后90%融合;傳代細(xì)胞的增殖潛伏期明顯變短,達(dá)到90%融合需要5d左右;第5代細(xì)胞均勻一致。原代ADSCs于1d后貼壁,9d 90%融合;傳代細(xì)胞的潛伏期明顯變短,達(dá)到90%融合需要5d左右;倒置相差顯微鏡下可觀察到第5代細(xì)胞形態(tài)均勻一致,呈梭形,排列比第5代BMSCs稍整齊。經(jīng)CD44免疫細(xì)胞化學(xué)和以CD29、CD34、CD44、CD90為細(xì)胞表型的流式細(xì)胞儀檢測證實其具有干細(xì)胞特征。 討論及結(jié)論采用酶消化法獲得的ADSCs和經(jīng)過貼壁法所獲得的BMSCs,在傳至第5代時、細(xì)胞形態(tài)一致,排列整齊;經(jīng)鑒定,傳代后的ADSCs和BMSCs仍擁有干細(xì)胞特征,適合進(jìn)一步誘導(dǎo)分化研究。 第二部分ADSCs和BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 目的比較傳代培養(yǎng)至第5代的ADSCs和BMSCs在分別加入“bFGF+EGF”之后的誘導(dǎo)分化規(guī)律,以及兩種細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的差異。 方法對傳代培養(yǎng)至第5代的ADSCs和BMSCs,以含有0.5%胎牛血清的DMEM/F12,加入10ng/ml表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、20 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)進(jìn)行誘導(dǎo)分化。3d后補充一次因子,7d換液,細(xì)胞90%融合后按1:2傳代。用Western blot和免疫組化法觀察誘導(dǎo)各個時間點(6h、12h、24h、72h、1w、2w)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物(Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP)的情況,并做統(tǒng)計學(xué)分析。觀察誘導(dǎo)1w后細(xì)胞在掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)下的形態(tài)學(xué)特征。 統(tǒng)計學(xué)分析照片由CCD成像系統(tǒng)獲得。陽性細(xì)胞計數(shù)方法:選取3個樣本,每個樣本隨機取10個不重疊視野(200×),選取100個細(xì)胞,計數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù),并做統(tǒng)計學(xué)分析。陽性率用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;比較兩種來源細(xì)胞(ADSCs和BMSCs)同一個時期同一種染色的陽性率采用“獨立樣本的t檢驗”;兩種細(xì)胞同一種染色隨時間變化規(guī)律采用“單向方差分析”。統(tǒng)計軟件用SPSS(版本13.0)、P＜0.05為有顯著性差異、有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果誘導(dǎo)前,ADSCs和BMSCs中的少量細(xì)胞呈Nestin陽性染色,顯微鏡觀察亦有少量神經(jīng)元樣細(xì)胞存在;誘導(dǎo)后,ADSCs和BMSCs均分化出更多的神經(jīng)元樣細(xì)胞,但其中由BMSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞突起更長,誘導(dǎo)后72h,誘導(dǎo)細(xì)胞相連形成網(wǎng)狀。具體變化:給予bFGF+EGF誘導(dǎo)6h后,兩種細(xì)胞即出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上的改變,即誘導(dǎo)分化后的BMSCs(differentiated BMSCs,dBMSCs)和誘導(dǎo)分化后的ADSCs(differentiated ADSCs,dADSCs)開始收縮、形成胞體呈圓形的多突起細(xì)胞,表達(dá)Nestin陽性的dADSCs和dBMSCs分別迅速增至75.2±2.8和55.2±2.8。隨著誘導(dǎo)時問點延長、Nestin陽性的細(xì)胞在dADSCs和dBMSCs的表達(dá)均呈下降趨勢,誘導(dǎo)72h和1w后,dADSCs和dBMSCs均檢測不到Nestin陽性細(xì)胞;誘導(dǎo)后24h,dADSCs和dBMSCs表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ,其陽性率均在誘導(dǎo)1w時達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)水平,并保持到2w;同時,dADSCs和dBMSCs都很少分化為表達(dá)GFAP陽性的細(xì)胞。 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,dADSCs隨時間變化的Nestin陽性表達(dá)漸少(F=1877.764,P=0.000)、β-tubulinⅢ陽性表達(dá)漸增(F=882.435,P=0.000)趨勢,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);同時,dBMSCs隨時間變化的Nestin陽性表達(dá)漸少(F=2158.746,P=0.000)和β-tubulinⅢ陽性表達(dá)漸增(F=1800.764,P=0.000)趨勢亦具有顯著性差異(P＜0.05)。由此提示,本研究采用的誘導(dǎo)方法可以成功地將ADSCs和BMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞。而經(jīng)過ADSCs和BMSCs在誘導(dǎo)后不同時間點同一種染色陽性率的比較,均顯示為P＜0.05,提示每種染色陽性率的變化在不同時間點都有顯著性差異、具有統(tǒng)計學(xué)意義;其中dADSCs隨誘導(dǎo)時間遞增而表達(dá)β-tubulinⅢ逐漸增強的能力(24h、72h、1w、2w分別為35.0±6.4、62.7±2.2、87.0±2.5、83.2±5.1)明顯大于dBMSCs(24h、72h、1w、2w分別為10.1±2.7、46.5±2.4、68.6±5.1、70.5±3.8),表明dADSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力、比dBMSCs更強。Western blot結(jié)果也支持上述推論。 討論及結(jié)論本實驗結(jié)果提示,經(jīng)過特定細(xì)胞因子的誘導(dǎo),ADSCs和BMSCs可以發(fā)生形態(tài)學(xué)和表型的變化,分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。在誘導(dǎo)前,Nestin和GFAP在ADSCs和BMSCs呈低水平表達(dá),而β-tubulinⅢ隨著誘導(dǎo)時間的延長,在dADSCs和dBMSCs中逐漸呈顯著表達(dá)趨勢,提示在本實驗條件下,dADSCs和dBMSCs隨著誘導(dǎo)時間的遞增而逐漸趨向于向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。值得一提的是,本實驗發(fā)現(xiàn)兩種來源的MSCs,雖經(jīng)bFGF和EGF誘導(dǎo)、卻仍極少分化為GFAP陽性的細(xì)胞,在提示ADSCs和BMSCs具有一定可塑性的同時、也提示了微環(huán)境對這兩種干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的影響作用。 由ADSCs和BMSCs在相同誘導(dǎo)條件下出現(xiàn)顯著差異的分化結(jié)果可以推測,dADSCs分化為β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞的能力更強,與BMSCs相比、ADSCs具有更強的向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化的潛能;在中樞神經(jīng)疾病的治療和損傷修復(fù)方面,可考慮以ADSCs作為BMSCs的替代、成為新的干細(xì)胞種子源。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 沈忠杰;自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于脊髓損傷處的存活及分化[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

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本文編號：2297293