【摘要】： 日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和登革病毒(dengue virus,DEN)為重要的經(jīng)蚊媒傳播的黃病毒。目前,對這兩種病毒致病的分子機(jī)理尚不清楚,因而阻礙了新型疫苗和特異藥物的研發(fā)。 臨床研究發(fā)現(xiàn),日本腦炎病毒和登革病毒的復(fù)制均可抑制患者體內(nèi)Ⅰ型干擾素的抗病毒作用。為此,本研究試圖比較和探討日本腦炎病毒Beijing-1株和登革2型病毒43株以及二者編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用機(jī)制,不但為深入了解蚊媒黃病毒致病的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ),而且對Ⅰ型干擾素在病毒病臨床治療中的合理應(yīng)用亦具有指導(dǎo)意義。 一、日本腦炎病毒和登革病毒在IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用首先利用含螢火蟲熒光素酶報告基因的載體pISRE-Luc,通過檢測熒光素酶活性對病毒感染細(xì)胞內(nèi)IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制程度進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示,感染登革病毒的細(xì)胞在IFN-α作用下,螢光素酶活性僅為對照組的73%;而感染日本腦炎病毒的細(xì)胞則更低,僅為對照組的12%。表明日本腦炎病毒和登革病毒均可抑制細(xì)胞內(nèi)IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,而且日本腦炎病毒對宿主細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用明顯強于登革病毒。 為進(jìn)一步分析日本腦炎病毒和登革病毒抑制宿主細(xì)胞內(nèi)IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制。本研究利用間接免疫熒光法觀察了在IFN-α作用下病毒感染細(xì)胞內(nèi)的STAT1分子的分布情況。并采用Western blotting分別檢測了在這兩種病毒感染狀態(tài)下宿主細(xì)胞內(nèi)STAT1分子的磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)日本腦炎病毒和登革病毒均可抑制宿主細(xì)胞內(nèi)IFN-α介導(dǎo)的STAT1分子的核轉(zhuǎn)運;而且在病毒感染細(xì)胞中STAT1分子的磷酸化水平明顯下降,但總的STAT1分子表達(dá)量未見改變。表明這兩種病毒感染并未影響細(xì)胞內(nèi)STAT1分子的表達(dá),而是抑制了STAT1分子的磷酸化,從而阻斷了STAT1的核轉(zhuǎn)運,導(dǎo)致IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中斷。由于STAT1分子的磷酸化是由其上游激酶分子JAK1和TYK2完成的。為此,本研究對兩種病毒感染細(xì)胞內(nèi)的JAK1和TYK2分子的磷酸化水平分別進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,在日本腦炎病毒感染的細(xì)胞內(nèi),TYK2和JAK1激酶的磷酸化水平均受到了明顯抑制。而在登革病毒感染細(xì)胞中僅TYK2分子的磷酸化水平顯著下降,JAK1分子的磷酸化未受影響。說明日本腦炎病毒同時干擾了JAK1和TYK2兩種激酶的活化,導(dǎo)致STAT1分子磷酸化水平降低,從而阻斷了JAK-STAT通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo);而登革病毒感染僅抑制了宿主細(xì)胞內(nèi)TYK2分子的磷酸化,從而降低STAT1分子的磷酸化水平。這表明日本腦炎病毒和登革病毒可能通過不同的作用機(jī)制抑制IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 二、日本腦炎病毒和登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白在IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用為深入了解日本腦炎病毒和登革病毒抑制Ⅰ型IFN介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制,本研究分別構(gòu)建了二者編碼的7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重組真核表達(dá)載體,觀察它們在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,以及對IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用,以期闡明在這兩種病毒抑制IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的病毒特異蛋白。 首先利用含螢火蟲熒光素酶報告基因的載體pISRE-Luc,在表達(dá)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞內(nèi),定量分析了IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化狀態(tài)。同時,為便于觀察病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用,構(gòu)建了融合表達(dá)紅色熒光蛋白的STAT1重組真核表達(dá)載體pRed-STAT1。將表達(dá)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的重組載體與pRed-STAT1共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的細(xì)胞內(nèi)定位情況。并觀察了表達(dá)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞內(nèi)IFN-α介導(dǎo)的STAT1分子的磷酸化水平。結(jié)果顯示,日本腦炎病毒和登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白均可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá),其中僅登革病毒的NS5定位于細(xì)胞核內(nèi),其它非結(jié)構(gòu)蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)中。在日本腦炎病毒的7種非結(jié)構(gòu)蛋白中,NS5不但顯著抑制了IFN-α介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,而且阻斷了STAT1分子的核轉(zhuǎn)運及其磷酸化水平。但并未發(fā)現(xiàn)登革病毒的NS5以及其它病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有明顯影響。表明日本腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5對Ⅰ型IFN系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有顯著的抑制作用,它可能是一種Ⅰ型IFN系統(tǒng)的拮抗蛋白。而登革病毒對Ⅰ型IFN系統(tǒng)的抑制作用并不依賴某一單獨的非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá),可能是通過多種病毒蛋白的協(xié)調(diào)作用或其它方式完成。 三、登革病毒NS4B在Ⅰ型干擾素系統(tǒng)中的作用 盡管有報道指出登革病毒NS4B具有抑制Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用,但在本研究系統(tǒng)中并未得到證實。為進(jìn)一步探討登革病毒NS4B的相關(guān)功能,本研究根據(jù)登革2型病毒NS4B的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果,分別在真核系統(tǒng)中表達(dá)了NS4B的8個不同區(qū)域,并發(fā)現(xiàn)NS4B氨基端的54個氨基酸殘基對其正確表達(dá)可能具有重要作用。同時,利用重組載體pRed-STAT1初步分析了NS4B的不同區(qū)域在IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用,結(jié)果表明,這些區(qū)域并未影響IFN-α介導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路�？梢姷歉锊《綨S4B對Ⅰ型干擾素系統(tǒng)的作用還有待進(jìn)一步探討。另外,本研究還在原核系統(tǒng)中表達(dá)了登革2和4型病毒的NS4B,并制備了相應(yīng)的多克隆抗體。在此過程中,發(fā)現(xiàn)NS4B羧基端的一級結(jié)構(gòu)在決定其免疫原性方面可能具有重要作用。以上這些結(jié)果為進(jìn)一步探討登革病毒NS4B對Ⅰ型干擾素系統(tǒng)作用的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。 本研究對日本腦炎病毒和登革病毒及其相關(guān)的主要非結(jié)構(gòu)蛋白在IFN-α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,為進(jìn)一步開展其它蚊媒黃病毒的相關(guān)研究提供了依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2296614