【摘要】： 目的 肺孢子菌肺炎(Pneumosystis pneumonia PCP),是由肺孢子菌引起的一種機會感染性致命性肺炎。常見于AIDS、惡性腫瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群,隨著艾滋病在世界各地的蔓延流行,器官移植的開展,免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,肺孢子菌的機會性感染將成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此,國內(nèi)外有許多學(xué)者致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究,但是至今尚無理想的防治措施問世。肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)是肺孢子菌的主要抗原成分之一,能刺激宿主產(chǎn)生抗肺孢子菌的保護性免疫反應(yīng)。但是肺孢子菌體外培養(yǎng)困難而致p55抗原來源受限,多個p55蛋白變異體的出現(xiàn)又使免疫效果受到影響,這些都對利用p55抗原進行免疫防治研究十分不利。本實驗是通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫結(jié)合生物軟件分析的方法,分析p55蛋白可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有較好抗原性參數(shù)的區(qū)域作為候選抗原表位,從5個p55蛋白變異體中共選取了十二個B細胞表位,將各表位進行串聯(lián)后形成嵌合體,人工合成串聯(lián)基因后進行體外表達,為PCP疫苗的深入研究提供實驗依據(jù)。 方法 一、抗原表位預(yù)測 運用生物信息學(xué)方法對p55蛋白的二級結(jié)構(gòu),親水性,穿膜螺旋,N-糖基化位點,氨基酸序列的親疏水性,表面可及性,分子柔韌性及抗原性參數(shù)進行預(yù)測分析,設(shè)計抗原表位多肽。 二、基因合成和測序鑒定 設(shè)計多表位的串聯(lián)基因,命名為TAG,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成及測序驗證。 三、TAG串聯(lián)基因原核表達載體的構(gòu)建及鑒定 將該TAG基因克隆到GST融合蛋白表達載體pGEX-6p-1上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG,受體菌為E.coli DH5α菌株。將該含有該重組質(zhì)粒的菌株于37℃增菌,按照小量質(zhì)粒提取試劑盒方法將過夜培養(yǎng)菌液提取質(zhì)粒,應(yīng)用限制性內(nèi)切酶進行酶切,行瓊脂糖凝膠電泳。 四、TAG串聯(lián)基因的擴增及表達 將被證實的含有重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG的E.coli DH5α,在LB液體培養(yǎng)基中37℃增菌,IPTG誘導(dǎo)其表達,將菌體變性后進行8%SDS-PAGE電泳。 五、Western Blotting分析 將表達目的蛋白和陽性對照GST蛋白的菌液離心后進行超聲破菌,收集上清后100℃變性5min,8%SDS-PAGE電泳。45V,3h冰浴,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉、0.1%BSA封閉2小時,以1∶500稀釋濃度加入Anti-GST-Ab抗體,4℃過夜。PBST漂洗三次,加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG,室溫孵育2h,用DAB顯色,30min內(nèi)觀察結(jié)果。 六、TAG表達蛋白的初步純化 提取包涵體,1、2、4、6M尿素充分振蕩、洗滌,將沉淀重懸含8M尿素的包涵體溶解緩沖液中于充分振蕩溶解包涵體后,4℃離心,收取上清,將沉淀用PBS重懸。將上清、沉淀作Western Blotting分析后,確定最好的洗滌濃度進行大量純化,以為下一步實驗做好準(zhǔn)備。 結(jié)果 一、抗原表位設(shè)計及基因合成 選取目前報道的肺孢子菌p55蛋白的5個變異體當(dāng)中有效抗原位點,共選取了十二個B細胞表位,將各表位進行串聯(lián),人工合成串聯(lián)基因,全長1180bp,命名為TAG。 二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將串聯(lián)基因連接在原核表達載體pGEX-6p-1上,命名為pGEX-6p-1/TAG,該重組質(zhì)粒經(jīng)測序證明堿基序列及讀碼框架完全正確。此外該重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI,NotI消化,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳證實片段大小與預(yù)期吻合,質(zhì)粒構(gòu)建成功。 三、TAG在原核細胞中表達 攜帶重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG的E.coli DH5α經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后,8%SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白為分子量為69KD的GST融合蛋白,并出現(xiàn)于包涵體中。 四、Western Blotting印跡分析 分別攜帶質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG和pGEX-6p-1的E.coli DH5α表達出分子量約69KD的GST-TAG融合蛋白和約26KD的GST蛋白。Western Blotting結(jié)果表明這兩個蛋白能被Anti-GST-Ab識別,重組TAG蛋白被成功表達。 五、重組TAG蛋白的初步純化 尿素法純化重組TAG蛋白顯示其最佳洗滌濃度為4M尿素,用8M尿素進行溶解可得較好效果。 結(jié)論 本研究以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)設(shè)計了肺孢子菌p55蛋白抗原表位的串聯(lián)基因,成功地建立了表達多表位串聯(lián)基因的原核表達系統(tǒng)。為進一步研制以該多表位串聯(lián)基因為基礎(chǔ)的疫苗研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2292330