【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)及牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis, Mbovis)引起的一種慢性消耗性人獸共患病。該病不僅給畜牧業(yè)尤其是奶業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,而且嚴(yán)重威脅人類健康。目前已有證據(jù)表明結(jié)核病可在人和動物之間相互傳播,且大部分帶菌個體不發(fā)��；而作為目前國際上唯一得到官方認(rèn)可的用于結(jié)核病防治的疫苗卡介苗(BCG),只對兒童能夠進行有效的保護,對成人的保護效果極差。這些都給人類結(jié)核病的診斷和控制造成了巨大的障礙。目前用于結(jié)核病診斷的方法主要有胸部X光透視、細(xì)菌培養(yǎng)等檢測方法。臨床胸透對結(jié)核病診斷不具有特異性,細(xì)菌檢測對生物安全水平要求高,且分菌分離率低,費時費力。分子生物學(xué)方法雖有應(yīng)用,對儀器設(shè)備有一定的要求,且假陽性率高。因此,免疫學(xué)方法在結(jié)核病診斷方面應(yīng)用的一直受到關(guān)注。結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的細(xì)胞免疫和體液免疫呈分離狀態(tài),在感染初期以細(xì)胞免疫占優(yōu)勢,體液免疫產(chǎn)生較晚,與病程呈正相關(guān)。傳統(tǒng)的結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)方法主要是檢測細(xì)胞免疫階段的,該方法已沿用百年,是一種敏感的檢測方法。但該法特異性較差,不能識別卡介苗免疫與結(jié)核分枝桿菌感染；對于免疫低下個體或感染晚期的活動性結(jié)核患者的反應(yīng)可能為陰性。以血液檢測為基礎(chǔ)的IFN-γ體外釋放方法在國外已開始應(yīng)用,用于檢測結(jié)核分枝桿菌潛伏感染具有很高的靈敏度與特異性。早期所選用的抗原為PPD,由于PPD檢測具有上述缺陷,后期選用了特異性刺激蛋白CFP10/ESAT6國外試劑盒需要對淋巴細(xì)胞進行分離,操作復(fù)雜；且價格昂貴,檢測成本不能為我國國情所接受。為此,本研究建立了IFN-γ體外釋放方法用于結(jié)核病的診斷。此外,IFN-γ檢測法在區(qū)分潛伏感染與活動性結(jié)核方面靈敏度有待提高,且操作需要細(xì)胞培養(yǎng),相對復(fù)雜。為了提高結(jié)核病診斷的靈敏度與特異性,本研究進一步開展了結(jié)核病新型分子標(biāo)識的篩選,同時利用已被認(rèn)識的分子標(biāo)識,構(gòu)建了改良BCG,初步研究了改良BCG的免疫效果。論文主要研究內(nèi)容如下： 1.結(jié)核病新型分子標(biāo)識的篩選 利用蛋白芯片技術(shù),用結(jié)核分枝桿菌特異蛋白CFP10/ESAT6(后簡稱CE蛋白)模擬結(jié)核菌對全血進行刺激,取上清液進行細(xì)胞因子芯片(RayBiotech516點)分析,檢測510種細(xì)胞因子。經(jīng)CE蛋白刺激后,有67種細(xì)胞因子表達(dá)量增高了1.9倍以上,43種下調(diào)了至少2.0倍。其中包括炎性因子,免疫調(diào)節(jié)因子,趨化因子,生長因子,血管原性因子,可溶性受體,粘附因子等。 對活動性結(jié)核病人、潛伏感染者、肺癌病人和健康對照人的血漿進行了蛋白芯片分析(SpringBio芯片656點),檢測651個蛋白,通過比較不同感染狀態(tài)的血漿蛋白差異表達(dá)情況,結(jié)果僅在活動性結(jié)核病人血漿中表達(dá)升高1.9倍以上的蛋白有21種,下調(diào)2.0倍以上的蛋白有72種。在上調(diào)的蛋白中包括角蛋白,神經(jīng)絲蛋白,與基因修復(fù)相關(guān)蛋白,熱休克蛋白等。 2.人IFN-γ基因的克隆、測序及蛋白的表達(dá)純化 根據(jù)GenBank人IFN-γ的基因序列(GenBank Accession No. NM000619)人工合成人IFN-γ基因全序列,并克隆至pET28a載體中,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒hIFN-γ-pET28a,并將其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h后獲得高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。提取包涵體并純化至電泳純。 3. hIFN-γ單克隆抗體及多克隆抗體的研究 用重組蛋白hIFN-γ-pET28a作免疫原,制備了能夠穩(wěn)定分泌的雜交瘤細(xì)胞和兔高免血清。利用間接ELISA方法對誘生的小鼠腹水及兔高免血清進行效價測定,結(jié)果表明單克隆抗體效價大于215,多克隆抗體效價大于212。通過單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果表明所制備的單克隆抗體類型為IgG1。 4.IFN-γ體外釋放方法的建立及其在人結(jié)核病檢測中的應(yīng)用 利用制備的單克隆抗體及多克隆抗體建立了檢測IFN-γ的雙抗夾心ELISA方法,引入本實驗室串聯(lián)表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌特異蛋白CFP10/ESAT6,對全血進行刺激,取上清液進行ELISA檢測,并通過與陽性對照刺激物和陰性對照刺激物的比較來判定樣本是否接觸過結(jié)核。該方法能夠?qū)CG和結(jié)核病感染進行鑒別診斷,并且能夠有效檢測出潛伏感染個體,且敏感性可達(dá)到94.6%(105／111),在284名健康對照人中,檢測出陰性結(jié)果236個,陰性檢出率83.1%(236／284)。 5.結(jié)核病重組疫苗的研究 對結(jié)核分枝桿菌中具有高免疫原性的基因Ag85B、Rv3872、CFP10、ESAT6,進行串聯(lián)表達(dá),整合至載體pTIC6a中,通過電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BCG和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, M.S.)中獲得重組BCG (rBCG)與重組恥垢分枝桿菌(rM.S.)。將重組菌免疫小鼠。檢測小鼠血清抗體和脾細(xì)胞增殖能力、及免疫后10周脾細(xì)胞刺激上清液中IFN-γ和IL-4分泌水平。結(jié)果表明免疫后4周起,rBCG組小鼠血清抗體和脾細(xì)胞增殖能力明顯高于BCG組；免疫10周后rBCG組小鼠IFN-γ分泌量高于BCG組小鼠,且差異顯著(P=0.022)。以上結(jié)果表明,rBCG能同時誘發(fā)更高的細(xì)胞與體液免疫反應(yīng),具有較好的應(yīng)用前景。rM.S.疫苗雖然能夠在一定程度上激發(fā)機體的免疫反應(yīng),但免疫反應(yīng)的強度和持續(xù)性不如BCG和rBCG。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2292630