【摘要】： 目的：1.探討肺間質(zhì)樹突狀細(xì)胞(DCs)的免疫表型及功能變化在MODS模型早期過度炎癥反應(yīng)和晚期免疫抑制中的作用。2.證實(shí)MODS期肺間質(zhì)DCs存在免疫耐受現(xiàn)象,探討DCs負(fù)向調(diào)節(jié)作用對肺組織損傷的影響。3.應(yīng)用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和Flt3配體(Flt3L)分別針對MODS早期過度炎癥和晚期免疫抑制中DCs功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性干預(yù)調(diào)節(jié),觀察減輕肺組織損傷和改善臟器功能的效果。 方法：腹腔注射酵母多糖復(fù)制Balb／c小鼠MODS模型。主要實(shí)驗(yàn)分組：急性損傷組(n=30)：酵母多糖注射后48h取材；NAC治療組(n=30)：酵母多糖注射后3h、6h、12h、18h、24h、36h皮下注射NAC(100mg／kg體重),48h取材；MODS組(n=30)：酵母多糖注射后10d取材；Flt3L治療組(n=20)：酵母多糖注射后48h開始每日皮下注射rFlt3L(10μg／只,連續(xù)注射7d),第10d取材；對照組(n=20)：以等量生理鹽水替代酵母多糖和NAC或rFlt3L按上述時(shí)間注射。每組小鼠按不同時(shí)間點(diǎn)麻醉后摘眼球取血,肺血管灌注,摘取雙側(cè)肺,按不同實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行固定、超低溫凍存、酶消化或勻漿處理。自動生化分析儀檢測CO2、ALT、AST、Cr等血生化指標(biāo)。生化法檢測肺組織MPO活性。ELISA法檢測血清和肺組織勻漿TNF-α含量。光鏡觀察肺組織病理變化,CD205免疫組化和CD11c免疫熒光標(biāo)記肺間質(zhì)DCs。密度梯度離心分離肺低密度單個(gè)核細(xì)胞,MACS磁珠分選DCs,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DCs鑒定和免疫表型分析(I-Ad、CD86、PD-L1)。掃描和透射電鏡觀察DCs的超微形態(tài)。凝膠電泳遷移率變動分析法檢測DCs胞核內(nèi)NF-κB含量和活性。Real-time PCR檢測DCs的CCR5/CCR7mRNA表達(dá)。體外LPS刺激DCs,ELISA法檢測DCs孵育上清液細(xì)胞因子IL-12p70和IL-10含量。 結(jié)果：1.正常Balb／c小鼠肺間質(zhì)DCs分為三個(gè)亞群：髓系CD11c+CD11b+DCs、類漿系CD11c+CD45R＼B220+DCs、淋巴系CD11c+CD11b-／CD45R＼B220-DCs,分別占肺單個(gè)核細(xì)胞比例的6.35%、1.96%、3.21%。肺間質(zhì)DCs高表達(dá)髓系標(biāo)志物CD11b(39.59%),低表達(dá)MHC-Ⅱ／Ⅰ-Ad(8.97%)和共刺激分子CD86(3.16%)。DCs表面見長1-2μm樹枝狀突起,細(xì)胞器不發(fā)達(dá),未見各級溶酶體和吞噬顆粒,細(xì)胞核形狀不規(guī)則。2.急性損傷組(與對照組比較),血CO2含量降低,肺組織和血清TNF-α水平顯著上升。肺含水量增加,肺組織MPO活性顯著增高。肺間質(zhì)CD11c+DCs數(shù)量增加,DCs體積增大,表面突起增多、變長。DCs表面I-Ad和共刺激分子CD86表達(dá)顯著增高,趨化因子受體CCR5表達(dá)顯著增加,CCR7表達(dá)輕度升高。DCs的NF-κB胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移和活性增加。3.NAC治療組(與急性損傷組比較),肺含水量、肺組織MPO活性和TNF-α水平明顯降低,血CO2含量升高,DCs的NF-κB細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移和活性降低,DCs表面I-Ad和CD86表達(dá)降低,CCR5和CCR7表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)鼠急性損傷期死亡率降低20%。4.MODS組,血清ALT、AST、脂肪酶、淀粉酶和肌苷水平較對照組顯著升高,血葡萄糖水平明顯下降。肺間質(zhì)髓系與類漿系DCs亞群比例及CD205+DCs數(shù)量較對照組明顯降低,而淋巴系DCs比例明顯升高。DCs表達(dá)I-Ad和CD86較對照組和急性損傷組明顯下降,DCs表達(dá)耐受性分子PD-L1增高十分顯著。電鏡下DCs多呈退變與凋亡改變。在體外實(shí)驗(yàn)LPS刺激后,DCs分泌IL-12p70水平較對照組和急性損傷組明顯下降而IL-10水平顯著升高。5.Flt3L治療組(與MODS組比較),髓系和類漿系DCs亞群比例較MODS組明顯增加,淋巴系DCs比例降低。DCs表達(dá)I-Ad+、CD86及CD205+DCs數(shù)量較MODS組顯著增加,DCs表達(dá)PD-L1明顯下降。體外LPS刺激后,DCs分泌IL-12p70水平顯著回升。肺組織損傷明顯減輕,血清ALT、AST和肌苷水平較MODS組均有明顯下降,血糖水平上升。實(shí)驗(yàn)鼠MODS期死亡率降低12%。 結(jié)論：1．利用密度梯度離心和免疫磁珠分離、純化肺間質(zhì)DCs,獲得DCs純度高,活性良好,免疫表型穩(wěn)定,但操作步驟復(fù)雜,技術(shù)要求較高。2.MODS急性損傷期,肺間質(zhì)DCs大量成熟活化導(dǎo)致免疫應(yīng)答反應(yīng)亢進(jìn)和炎癥反應(yīng)失控。肺間質(zhì)DCs功能紊亂是引起肺過度炎癥損傷的主要免疫細(xì)胞學(xué)因素。3.N-乙酰-L-半胱氨酸體內(nèi)干預(yù)能夠降低肺間質(zhì)DCs的NF-κB胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移和活性,從而抑制DCs分化成熟和趨化遷移,減弱炎癥反應(yīng),進(jìn)而減輕MODS急性損傷期的肺組織損傷。4.MODS期,肺間質(zhì)DCs活性減低(表達(dá)I-Ad和CD86比例下降),發(fā)生免疫耐受(DCs表達(dá)PD-L1顯著升高),并通過大量分泌IL-10發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。DCs的免疫耐受作用參與誘導(dǎo)和促進(jìn)了免疫抑制與肺功能衰竭。5.Flt3L體內(nèi)擴(kuò)增DCs作用能夠增加肺間質(zhì)髓系和類漿系DCs亞群及成熟DCs比例,致DCs分泌IL-12p70增加,正向免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)。Flt3L可以明顯逆轉(zhuǎn)MODS期肺間質(zhì)DCs的免疫耐受狀態(tài),進(jìn)而減輕肺組織損傷和改善臟器功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R459.7;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2272867