【摘要】： 目的 人類天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是一種具有細(xì)胞毒作用的淋巴細(xì)胞,在天然免疫中起著重要作用,能迅速誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞的凋亡。NK細(xì)胞執(zhí)行殺傷功能的途徑有多種,包括Fas-L、TRAIL、穿孔素-顆粒酶途徑;其中最主要的一條途徑是穿孔素-顆粒酶途徑。當(dāng)NK細(xì)胞和靶細(xì)胞接觸后,NK細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞毒顆粒進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。 NK細(xì)胞能夠分泌多種顆粒酶,包括顆粒酶A、B、H、K和M。顆粒酶基因在染色體的排列位置接近,而且具有共同的保守序列。顆粒酶B和顆粒酶H基因有90%是一致的;顆粒酶A和顆粒酶K也有很強(qiáng)的同源性。在五種顆粒酶中,顆粒酶B是目前研究最多的一種,而且在殺傷靶細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用。顆粒酶B殺傷靶細(xì)胞是通過半胱天冬酶依賴的凋亡途徑;而顆粒酶A是通過誘導(dǎo)DNA單鏈斷裂來誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的。因?yàn)樽饔玫牡孜镞�不清楚,顆粒酶H和顆粒酶K被稱為孤兒酶,并且它們誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡不依賴半胱天冬酶凋亡途徑。顆粒酶M是通過半胱天冬酶依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的。 IL-2、IL-12、IL-15和IFNα是最重要的調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子,能夠提高淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。已經(jīng)有文章報(bào)道IL-2、IL-12、IL-15和IFNα可以提高NK細(xì)胞殺傷效應(yīng)分子的表達(dá),促進(jìn)靶細(xì)胞的凋亡。盡管如此,IL-2、IL-12、IL-15和IFNα是否可以調(diào)節(jié)顆粒酶的表達(dá),進(jìn)而改變NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,以及它們的調(diào)控模式是否一致等一系列科學(xué)問題尚不清楚。為了證明上述問題,我們選用實(shí)時定量PCR來檢測顆粒酶基因的改變,免疫印跡檢測顆粒酶蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化,細(xì)胞毒活性確定顆粒酶變化與NK細(xì)胞殺傷功能的關(guān)系 方法 1.實(shí)時定量PCR檢測IL-2、IL-12、IL-15和IFNα對NK-92細(xì)胞系表達(dá)顆粒酶基因的影響 2.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測IL-2和IFNα對NK-92細(xì)胞系表達(dá)顆粒酶B蛋白的影響 3.MACS柱分離純化人外周血NK細(xì)胞 4.流式細(xì)胞術(shù)分析人外周血NK細(xì)胞的純度 5.小干擾RNA沉默顆粒酶B基因,檢測顆粒酶B對NK細(xì)胞殺傷功能的影響。 6.MTT方法檢測NK-92細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷作用 結(jié)果 1.IL-2上調(diào)NK-92細(xì)胞中顆粒酶A和B基因轉(zhuǎn)錄水平 2.IL-15可以上調(diào)NK-92細(xì)胞中顆粒酶A和顆粒酶B基因轉(zhuǎn)錄水平,下調(diào)顆粒酶H基因轉(zhuǎn)錄水平 3.IL-12提高NK-92細(xì)胞中顆粒酶A和B的基因轉(zhuǎn)錄水平 4.IFNα上調(diào)顆粒酶A、B和K的基因轉(zhuǎn)錄水平 5.IL-2、IL-12、IL-15和IFNα調(diào)節(jié)NK-92細(xì)胞表達(dá)顆粒酶的模式不同 6.IL-2和IFNα提高NK-92細(xì)胞殺傷能力部分依賴于顆粒酶B蛋白表達(dá)水平 7.IL-2和IFNα上調(diào)人外周血分離的NK細(xì)胞的顆粒酶B基因表達(dá)水平。 結(jié)論 與其它幾種顆粒酶相比,顆粒酶B對四種細(xì)胞因子的刺激更加敏感,尤其是對于IL-2。IL-15可以上調(diào)顆粒酶A和B的表達(dá),下調(diào)顆粒酶H的表達(dá)。IL-12也可以上調(diào)顆粒酶A和B基因水平的表達(dá)。不同的是,IFNα可以上調(diào)顆粒酶K基因水平的表達(dá)。IL-2和IFNα提高NK-92殺傷能力部分依賴于顆粒酶B蛋白表達(dá)水平。此外,IL-2和IFNα上調(diào)人外周血分離的NK細(xì)胞的顆粒酶基因表達(dá)水平。 總之,盡管IL-2、IL-12、IL-15、IFNα在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表達(dá)顆粒酶基因水平上有相似之處,但是它們的作用并不完全一致。它們獨(dú)特的作用機(jī)制可以解釋它們對NK細(xì)胞不同的調(diào)節(jié)功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2261615