【摘要】： 目的 人類天然殺傷細胞(NK細胞)是一種具有細胞毒作用的淋巴細胞,在天然免疫中起著重要作用,能迅速誘導病毒感染細胞或者腫瘤細胞的凋亡。NK細胞執(zhí)行殺傷功能的途徑有多種,包括Fas-L、TRAIL、穿孔素-顆粒酶途徑;其中最主要的一條途徑是穿孔素-顆粒酶途徑。當NK細胞和靶細胞接觸后,NK細胞能夠分泌細胞毒顆粒進入靶細胞內(nèi)。 NK細胞能夠分泌多種顆粒酶,包括顆粒酶A、B、H、K和M。顆粒酶基因在染色體的排列位置接近,而且具有共同的保守序列。顆粒酶B和顆粒酶H基因有90%是一致的;顆粒酶A和顆粒酶K也有很強的同源性。在五種顆粒酶中,顆粒酶B是目前研究最多的一種,而且在殺傷靶細胞中起著至關重要的作用。顆粒酶B殺傷靶細胞是通過半胱天冬酶依賴的凋亡途徑;而顆粒酶A是通過誘導DNA單鏈斷裂來誘導靶細胞凋亡的。因為作用的底物還不清楚,顆粒酶H和顆粒酶K被稱為孤兒酶,并且它們誘導靶細胞凋亡不依賴半胱天冬酶凋亡途徑。顆粒酶M是通過半胱天冬酶依賴的凋亡途徑誘導靶細胞凋亡的。 IL-2、IL-12、IL-15和IFNα是最重要的調(diào)節(jié)免疫功能的細胞因子,能夠提高淋巴細胞的細胞毒作用。已經(jīng)有文章報道IL-2、IL-12、IL-15和IFNα可以提高NK細胞殺傷效應分子的表達,促進靶細胞的凋亡。盡管如此,IL-2、IL-12、IL-15和IFNα是否可以調(diào)節(jié)顆粒酶的表達,進而改變NK細胞的細胞毒作用,以及它們的調(diào)控模式是否一致等一系列科學問題尚不清楚。為了證明上述問題,我們選用實時定量PCR來檢測顆粒酶基因的改變,免疫印跡檢測顆粒酶蛋白質(zhì)水平的表達變化,細胞毒活性確定顆粒酶變化與NK細胞殺傷功能的關系 方法 1.實時定量PCR檢測IL-2、IL-12、IL-15和IFNα對NK-92細胞系表達顆粒酶基因的影響 2.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測IL-2和IFNα對NK-92細胞系表達顆粒酶B蛋白的影響 3.MACS柱分離純化人外周血NK細胞 4.流式細胞術分析人外周血NK細胞的純度 5.小干擾RNA沉默顆粒酶B基因,檢測顆粒酶B對NK細胞殺傷功能的影響。 6.MTT方法檢測NK-92細胞對K562細胞的殺傷作用 結果 1.IL-2上調(diào)NK-92細胞中顆粒酶A和B基因轉(zhuǎn)錄水平 2.IL-15可以上調(diào)NK-92細胞中顆粒酶A和顆粒酶B基因轉(zhuǎn)錄水平,下調(diào)顆粒酶H基因轉(zhuǎn)錄水平 3.IL-12提高NK-92細胞中顆粒酶A和B的基因轉(zhuǎn)錄水平 4.IFNα上調(diào)顆粒酶A、B和K的基因轉(zhuǎn)錄水平 5.IL-2、IL-12、IL-15和IFNα調(diào)節(jié)NK-92細胞表達顆粒酶的模式不同 6.IL-2和IFNα提高NK-92細胞殺傷能力部分依賴于顆粒酶B蛋白表達水平 7.IL-2和IFNα上調(diào)人外周血分離的NK細胞的顆粒酶B基因表達水平。 結論 與其它幾種顆粒酶相比,顆粒酶B對四種細胞因子的刺激更加敏感,尤其是對于IL-2。IL-15可以上調(diào)顆粒酶A和B的表達,下調(diào)顆粒酶H的表達。IL-12也可以上調(diào)顆粒酶A和B基因水平的表達。不同的是,IFNα可以上調(diào)顆粒酶K基因水平的表達。IL-2和IFNα提高NK-92殺傷能力部分依賴于顆粒酶B蛋白表達水平。此外,IL-2和IFNα上調(diào)人外周血分離的NK細胞的顆粒酶基因表達水平。 總之,盡管IL-2、IL-12、IL-15、IFNα在調(diào)節(jié)NK細胞表達顆粒酶基因水平上有相似之處,但是它們的作用并不完全一致。它們獨特的作用機制可以解釋它們對NK細胞不同的調(diào)節(jié)功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2261615