發(fā)布時(shí)間：2018-10-10 11:18

【摘要】： 人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES細(xì)胞)是從植入前早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)或原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)中分離得到并能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的高度未分化的全能細(xì)胞系。在體外特定的、適宜的培養(yǎng)體系中,人ES細(xì)胞可接近無限增殖,并保持未分化狀態(tài)和多向分化潛能。ES細(xì)胞為研究胚胎早期發(fā)育的分子機(jī)制提供了良好的細(xì)胞模型,切其經(jīng)合適的條件誘導(dǎo)可分化為外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個(gè)胚層來源且其經(jīng)合適的條件誘導(dǎo)可分化為外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個(gè)胚層來源的各種細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞和造血細(xì)胞等,因而有望成為神經(jīng)退行性疾病、心肌梗塞、糖尿病和血液病等疾病移植治療的重要種子細(xì)胞,具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。人ES細(xì)胞系首先是由Thomson等和Shamblott等于1998年分別從ICM和PGCs建立,此后一直是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 ES細(xì)胞的一個(gè)重要的特點(diǎn)就是具有自我更新能力,即細(xì)胞通過對(duì)稱分裂在維持全能性不丟失的情況下擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目。ES細(xì)胞自我更新能力的維持是體外培養(yǎng)、擴(kuò)增ES細(xì)胞的必要條件,也是ES細(xì)胞在科學(xué)和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。深入研究ES細(xì)胞自我更新機(jī)制具有重要意義,這也是當(dāng)前ES細(xì)胞研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。 過去的研究表明,多種因素參與調(diào)控人ES細(xì)胞自我更新,其中包括轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4、Nanog、Sox2等)、信號(hào)通路(TGFβ信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、FGF和PI3K信號(hào)通路等)、細(xì)胞周期調(diào)控因子、microRNA、染色質(zhì)重塑及DNA甲基化等。Oct-3/4、Nanog、Sox2是目前研究較多的參與調(diào)控人ES細(xì)胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子,它們之間可相互作用形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路,共同維持人ES細(xì)胞的多潛能性。除此之外,近來研究表明人ES細(xì)胞中還存在其它已知或未知基因參與其自我更新的調(diào)控過程,然而它們?cè)谌薊S細(xì)胞中的功能及調(diào)控機(jī)制仍需要深入研究。 本室在前期工作中通過用全基因組芯片比較未分化的人ES細(xì)胞(H9細(xì)胞)和7天擬胚體(7-day embryoid bodies,7-day EBs)的差異基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)一個(gè)EST序列(Genbank:BF223023)在未分化的人ES細(xì)胞中高表達(dá),而一旦細(xì)胞分化后其表達(dá)顯著降低(下調(diào)達(dá)20倍),經(jīng)RT-PCR和real-time PCR得以證實(shí)。進(jìn)一步通過EST拼接、5'-RACE等方法首次克隆得到一個(gè)只在未分化人ES細(xì)胞中高表達(dá)而在其它多種組織或細(xì)胞中均檢測(cè)不到表達(dá)的人胚胎干細(xì)胞特異性表達(dá)新基因,我們將該基因命名為HESRG (human embryonic stem cell related gene, HESRG),其在國(guó)際基因序列數(shù)據(jù)庫GenBank登錄號(hào)為DQ445779。除本室外,目前國(guó)內(nèi)外尚未見該基因相關(guān)研究的報(bào)道。 HESRG基因定位于人染色體3p14.3,基因組跨越6921bp,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,其cDNA全長(zhǎng)3141bp。將HESRG基因序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較,僅發(fā)現(xiàn)其與黑猩猩(Pantroglodytes)、恒河猴(Macaca mulatta)等靈長(zhǎng)類動(dòng)物部分序列同源。通過融合基因表達(dá)策略、Western Blot和免疫組化檢測(cè)等手段,本室前期工作已確定HESRG基因開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)669bp,編碼222個(gè)氨基酸,包含一個(gè)核定位信號(hào)及一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi),提示HESRG可能在人ES細(xì)胞中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。本室前期工作還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HESRG可促使人ES細(xì)胞向中胚層方向分化；使用化學(xué)合成siRNA干擾HESRG結(jié)果初步顯示HESRG基因的表達(dá)下調(diào)后人ES細(xì)胞呈現(xiàn)出分化細(xì)胞的表型,提示HESRG基因可能在人ES細(xì)胞自我更新中起重要作用。本研究擬在上述研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用化學(xué)合成siRNA、慢病毒RNAi載體和可誘導(dǎo)RNAi技術(shù)等多種手段全面研究人ES細(xì)胞中HESRG的功能。 [檢測(cè)HESRG特異性表達(dá)及其亞細(xì)胞定位] 通過RT-PCR檢測(cè)在小鼠ES細(xì)胞和人ES細(xì)胞的HESRG mRNA水平表達(dá),結(jié)果顯示只在人ES細(xì)胞檢測(cè)到.HESRG,在小鼠ES細(xì)胞未檢測(cè)到HESRG表達(dá)。 通過生物信息學(xué)方法(JW方法)篩選找到HESRG蛋白抗原表位,合成特異性多肽,然后將其C末端氨基酸偶聯(lián)匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH),免疫新西蘭大白兔,每只均經(jīng)過四次免疫,采集兔免疫血清,親和層析純化,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定抗體效價(jià),由此制備了HESRG特異性抗體。隨后,我們利用HESRG抗體采用間接免疫熒光檢測(cè)HESRG在小鼠ES細(xì)胞和人ES細(xì)胞的表達(dá),結(jié)果顯示在小鼠ES細(xì)胞未檢測(cè)到HESRG蛋白表達(dá),在人ES細(xì)胞檢測(cè)到表達(dá),熒光信號(hào)定位于細(xì)胞核,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)HESRG的表達(dá)分析,進(jìn)一步證實(shí)HESRG是人ES細(xì)胞特異性表達(dá)基因,可能作為轉(zhuǎn)錄因子起作用。 [利用化學(xué)合成siRNA人ES細(xì)胞特異性表達(dá)基因] 化學(xué)合成針對(duì)HESRG的siRNA,轉(zhuǎn)染人ES細(xì)胞,通過相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。轉(zhuǎn)染24小時(shí),人ES細(xì)胞變得分散、扁平,開始分化；轉(zhuǎn)染48小時(shí)細(xì)胞分散、細(xì)長(zhǎng),出現(xiàn)絲狀物,似神經(jīng)前體細(xì)胞表型；轉(zhuǎn)染72小時(shí),細(xì)長(zhǎng)、絲狀物更加明顯,細(xì)胞形態(tài)仍似神經(jīng)前體細(xì)胞表型,但是部分細(xì)胞開始死亡。收集細(xì)胞,抽提RNA,通過RT-PCR在mRNA水平檢測(cè).HESRG基因、人ES細(xì)胞多潛能標(biāo)志基因(Oct4、Nanog)、神經(jīng)外胚層標(biāo)志基因(Nestin、Musashi1、FGF5、Sox1)、中胚層標(biāo)志基因(BRACHYURY(T)、Hand1)、內(nèi)胚層標(biāo)志基因(GATA6、AFP)、滋養(yǎng)外胚層標(biāo)志基因(CGa),檢測(cè)結(jié)果顯示抑制HESRG表達(dá)以后人ES細(xì)胞多潛能性標(biāo)志基因Oct4、Nanog表達(dá)均出現(xiàn)顯著下調(diào)；而神經(jīng)外胚層分化標(biāo)志基因Nestin表達(dá)顯著出現(xiàn)上調(diào)、Musashil表達(dá)上調(diào),未檢測(cè)到其它胚層標(biāo)志基因表達(dá)。 隨后,我們采用間接免疫熒光方法蛋白質(zhì)水平檢測(cè)HESRG、多潛能性標(biāo)志分子Oct4及各胚層分化標(biāo)志分子(Nestin、Musashi1、Hand1、GATA6、CGa)的表達(dá)情況,檢測(cè)結(jié)果顯示HESRG、Oct4表達(dá)在干擾后的細(xì)胞中顯著下調(diào),而神經(jīng)外胚層標(biāo)志分子Nestin的表達(dá)顯著升高,Musashi1表達(dá)水平升高。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從細(xì)胞形態(tài)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平三方面證明在HESRG基因表達(dá)被顯著抑制后,人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化,表明HESRG可能抑制人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化,參與人ES細(xì)胞自我更新。 [利用慢病毒干擾載體研究HESRG基因功能] 首先構(gòu)建HESRG基因的慢病毒干擾載體：將siRNA insert (shHESRG)插入慢病毒shRNA表達(dá)載體pRNATin-H1.4/Lenti中,通過電泳酶切和測(cè)序鑒定,shHESRG慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建正確,命名為pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG。該載體的啟動(dòng)子是包含兩個(gè)TetO元件的H1.4啟動(dòng)子。當(dāng)不存在其反式調(diào)控因子四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)時(shí),H1.4啟動(dòng)子可以像常規(guī)的H1啟動(dòng)子一樣啟動(dòng)shRNA的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)目的基因的表達(dá)。 為了獲得較高的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人ES細(xì)胞的效率,我們首先采用了受EF1α啟動(dòng)子(該啟動(dòng)子在人ES細(xì)胞中具有較強(qiáng)的活性)調(diào)控的報(bào)告基因(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因,EGFP)的慢病毒表達(dá)載體(pHAGE2-EF 1 aFull-ZsGreen-W)來摸索慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染人ES細(xì)胞的合適條件。采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行病毒包裝,將pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W 10μg、pMD2.G 5μg、psPAX2 7.5μg共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,72小時(shí)后收集病毒上清,3000rpm離心15分鐘去除細(xì)胞碎片,超速離心濃縮病毒上清。將濃縮后的病毒顆粒感染人ES細(xì)胞,72小時(shí)左右可觀察到綠色熒光信號(hào),感染效率與克隆的大小有一定關(guān)系,成功感染pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W的人ES細(xì)胞綠色熒光信號(hào)并沒有隨著傳代而消失,表明慢病毒顆粒攜帶EGFP表達(dá)穩(wěn)定持久。 采用同樣的方法進(jìn)行pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG包裝和感染人ES細(xì)胞。感染病毒顆粒的第五天左右可以觀察到人ES細(xì)胞變得分散、細(xì)長(zhǎng),似神經(jīng)前體細(xì)胞形態(tài)。收集細(xì)胞,提取RNA,通過realtime-PCR檢測(cè)mRNA水平上HESRG基因、多潛能標(biāo)志基因及各胚層標(biāo)志基因的表達(dá)改變。間接免疫熒光檢測(cè)檢測(cè)HESRG、多潛能性標(biāo)志分子Oct4及各胚層分化標(biāo)志分子(Nestin、Musashi1、GATA4、Hind1、CGα)表達(dá)情況。Realtime-PCR和間接免疫熒光結(jié)果與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siHESRG結(jié)果一致。 [可誘導(dǎo)RNAi方法研究HESRG基因功能] 四環(huán)素(tetracycline)誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效、可控制性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)可分為"Tet-off"和"Tet-on"系統(tǒng),其中"Tet-on"系統(tǒng)由于誘導(dǎo)的可控性更強(qiáng)而應(yīng)用更廣泛。"Tet-on"系統(tǒng)可受到四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline, Dox)嚴(yán)格調(diào)控,由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成,調(diào)節(jié)質(zhì)粒可表達(dá)TetR阻遏物,而反應(yīng)質(zhì)粒包含四環(huán)素反應(yīng)元件(Tet responsive element, TRE),如’TetO。在沒有Dox存在的情況下,TetR可以與TRE結(jié)合,抑制啟動(dòng)子活性,關(guān)閉下游目的基因或shRNA的表達(dá)；而加入Dox后,Dox可以與TetR阻遏物結(jié)合,使之不能與TRE結(jié)合,從而使下游目的基因或shRNA高效表達(dá)。已有研究報(bào)道表明"Tet-on"可誘導(dǎo)系統(tǒng)能夠有效地應(yīng)用在人ES細(xì)胞中。鑒于HESRG表達(dá)被干擾后導(dǎo)致人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層細(xì)胞分化,我們擬進(jìn)一步利用"Tet-on"系統(tǒng)在人ES細(xì)胞中建立一個(gè)可誘導(dǎo)的HESRG特異性的shRNA表達(dá)系統(tǒng),然后再精密調(diào)控HESRG表達(dá)水平,以詳細(xì)研究HESRG在細(xì)胞自我更新和分化中的作用。 首先建立表達(dá)TetR的人ES細(xì)胞系。通過轉(zhuǎn)染TetR表達(dá)質(zhì)粒(pCAG-TetRnls)于H9人胚胎干細(xì)胞系,加入puromycin (2μg/ml)進(jìn)行篩選得到抗性克隆。采用RT-PCR檢測(cè)TetR mRNA表達(dá)水平,Western Blot檢測(cè)TetR蛋白表達(dá)水平；從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面未分化抗原(TRA-1-60、SSEA-3)、多潛能標(biāo)志物、堿性磷酸酶(AKP)、細(xì)胞分化潛能(體外實(shí)驗(yàn))對(duì)TetR表達(dá)水平最高的人ES細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,我們獲得了高表達(dá)TetR的人ES細(xì)胞系并命名為H9-TetR, H9-TetR和H9細(xì)胞系一樣具有多潛能分化和自我更新特性,可以用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定表達(dá)TetR的人ES細(xì)胞系構(gòu)建成功,為在人ES細(xì)胞建立可誘導(dǎo)干擾系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 如前所述,pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG載體的inH1.4啟動(dòng)子包含TetO元件。當(dāng)存在TetR阻遏物時(shí),TetR可以與TetO元件結(jié)合,抑制H1啟動(dòng)子活性,從而關(guān)閉shRNA表達(dá),而四環(huán)素或四環(huán)素衍生物Dox則能與TetR結(jié)合并去除TetR對(duì)H1啟動(dòng)子的抑制,從而啟動(dòng)shRNAs的表達(dá)。將濃縮的pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG病毒顆粒感染H9-TetR細(xì)胞。與前面轉(zhuǎn)染空白H9細(xì)胞導(dǎo)致其發(fā)生分化的情況不同,轉(zhuǎn)染的H9-TetR細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化,仍呈緊密、克隆狀生長(zhǎng)。加入G418篩選,挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆,命名為H9-TetR-shHESRG細(xì)胞。然后,加入Dox (1μg/ml濃度)誘導(dǎo)H9-TetR-shHESRG細(xì)胞中HESRG shRNA的表達(dá),48小時(shí)后,細(xì)胞變得分散、細(xì)長(zhǎng),開始分化；而未加Dox誘導(dǎo)的H9-TetR-shHESRG細(xì)胞仍呈緊密克隆狀生長(zhǎng),說明我們已初步在人ES細(xì)胞建立了可誘導(dǎo)干擾系統(tǒng)。 綜上所述,本研究從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)到HESRG在人ES細(xì)胞特異表達(dá),其蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核。利用化學(xué)合成siRNA、慢病毒shRNA表達(dá)載體和可誘導(dǎo)shRNA系統(tǒng)等三種RNAi技術(shù)手段成功地抑制了HESRG表達(dá),且均觀察到HESRG表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致人ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化,表明HESRG新基因可以通過抑制神經(jīng)外胚層分化維持人ES細(xì)胞自我更新。此外,我們已初步在人ES細(xì)胞中建立了HESRG新基因的可誘導(dǎo)干擾系統(tǒng),為進(jìn)一步深入研究該新基因在人ES細(xì)胞中起作用的分子機(jī)制及人ES細(xì)胞自我更新機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 劇世強(qiáng);芮榮;;MicroRNA在多能干細(xì)胞的表達(dá)與功能[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年02期

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本文編號(hào)：2261565