【摘要】： 第一部分:TGF-?1預(yù)處理在BMSC凋亡過程中的作用 引文:BMSC即骨髓間充質(zhì)干細胞,是存在于骨髓基質(zhì)中的非造血組織的間充質(zhì)干細胞,它具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞分化的能力。在機體受到外傷,疾病,老化等損傷時,BMSC可增殖分化,并可釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子,如BDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子),NGF(神經(jīng)生長因子),并參與神經(jīng)組織損傷的修復(fù)。BMSC主要應(yīng)用于移植,但是在單純移植BMSC后,BMSC易受到各種外界環(huán)境因素的影響而凋亡,不能較好地參與組織損傷修復(fù)過程。本研究應(yīng)用小劑量轉(zhuǎn)化生長因子-β1對BMSC進行預(yù)處理,觀察小劑量轉(zhuǎn)化生長因子-β1預(yù)處理是否使BMSC具有抗凋亡的能力。目的:觀察經(jīng)TGF-β1預(yù)處理后的BMSC凋亡的情況,并篩選出使BMSC具有最強抗凋亡能力的條件,即TGF-β1預(yù)處理的時間點和濃度。方法:選取對數(shù)生長期的P2代BMSCs ,用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,改用含0. 5 %新生小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時,使細胞趨于同步化。將骨髓間充質(zhì)干細胞懸液稀釋成5×104/ml,接種在6孔細胞培養(yǎng)板中,每孔10ml細胞懸液,分為預(yù)處理組及空白對照組,分別在預(yù)處理組的各孔中加入2ng/mlTGF-β1,不加TGF-β1為空白對照組,預(yù)處理組又分為TGF-β1預(yù)處理后24小時,48小時,72小時組。再將各組細胞改用無血清培養(yǎng)基(作為一種誘導(dǎo)凋亡的條件)培養(yǎng)48小時,并用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況。結(jié)果:1.體外分離純化的骨髓MSCs,所挑取的單克隆擴增細胞呈典型成纖維樣細胞形態(tài).2.光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)BMSC在TGF-β1預(yù)處理后12小時開始凋亡,24小時呈繼續(xù)上升趨勢,48小時時凋亡細胞數(shù)開始減少,72小時凋亡細胞數(shù)又繼續(xù)增多。3.經(jīng)24小時,48小時,72小時預(yù)處理組的細胞凋亡率(AI%)分別為33.5% , 23.2 % ,52.2 %。4.相應(yīng)的空白對照組在24小時,48小時,72小時的細胞凋亡率(AI%)分別為31.2% ,47.2% ,56.3%。結(jié)論:經(jīng)2ng/ml TGFβ-1預(yù)處理48小時后的骨髓間充質(zhì)干細胞具有較強抗凋亡能力。經(jīng)2ng/ml TGFβ-1預(yù)處理48小時的BMSC可以在無血清培養(yǎng)基中生存48個小時。TGF-β1在特定條件下對骨髓間充質(zhì)干細胞具有保護作用,可以抑制其凋亡,提高BMSC在移植過程中的存活率。 第二部分:TGF-?1預(yù)處理對抗BMSC凋亡作用機制的研究 引言:細胞凋亡是細胞的死亡形式之一, caspase在誘發(fā)凋亡過程中是起著必不可少的作用,而Bcl-2基因及其蛋白則是抑制細胞凋亡的重要物質(zhì)。本研究用免疫組化方法檢測經(jīng)小劑量TGF-β1預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞中BCL-2和Caspase-3的表達,旨在探討小劑量轉(zhuǎn)化生長因子-β1預(yù)處理使BMSC具有抗耐受凋亡的能力的原因及機制。目的:通過檢測經(jīng)TGF-β1預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞中BCL-2和Caspase-3的表達,研究小劑量轉(zhuǎn)化生長因子-β1預(yù)處理具有對抗BMSC凋亡的作用機制。方法:將骨髓間充質(zhì)干細胞懸液稀釋成5×104/ml,接種在6孔細胞培養(yǎng)板中,分為預(yù)處理組及空白對照組,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于24小時、48小時、72小時后,收集細胞并制備細胞爬片.免疫細胞化學(xué)染色檢測BCL-2,caspase-3的表達。每種抗原的染色均分實驗組和對照組。常規(guī)免疫細胞化學(xué)染色。陽性標(biāo)準(zhǔn)為棕黃色。各隨機抽取10個不重疊的視野,計算陽性細胞的數(shù)量,應(yīng)用HPIAS21000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng),對BCL-2,caspase-3的表達結(jié)果進行分析。結(jié)果: BMSCs BCL-2,Caspase-3的表達:BCL-2,CAS-3染色陽性部位在細胞膜和細胞漿,將3個預(yù)處理時間點的2組細胞進行免疫組化染色分析,并分別取5個不同視野,進行陽性細胞記數(shù)。24小時和72小時處理組的BCL-2表達及CASPASE-3表達較對照組差異顯著性不明顯(P0.05).48小時處理組的BCL-2表達較對照組顯著增加(P0.05), Caspase-3較對照組顯著減少(P0.05)。結(jié)論:經(jīng)2ng/ml的TGFβ-1預(yù)處理48小時的BMSC具有較強抗凋亡能力,其機制可能與增強BCL-2及減少Caspase-3表達密切相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王立新,楊琳;中醫(yī)藥誘導(dǎo)腦缺血損傷后神經(jīng)干細胞增殖分化研究概況[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2004年12期

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本文編號：2254983