【摘要】： 小分子半抗原單克隆抗體制備通常較復(fù)雜,且很多情況下,得到的抗體親和力較差,效價(jià)很低,無(wú)法滿(mǎn)足作為檢測(cè)性抗體的要求,在很大程度上限制了單克隆抗體的應(yīng)用。本研究以對(duì)硫磷為對(duì)象制備了單鏈抗體,旨在探索已知基因的半抗原基因工程抗體的構(gòu)建,同時(shí)通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建了未知抗體基因的抗微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)的單鏈抗體,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了四價(jià)抗體,為基因工程抗體在小分子半抗原類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)方面的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 參考GenBank中發(fā)表的對(duì)硫磷抗體序列,對(duì)其進(jìn)行分析后在重鏈可變區(qū)基因(heavy chain V-region, VH)和輕鏈可變區(qū)基因(light chain V-region, VL)之間加上了45個(gè)核苷酸作為連接肽序列,由公司合成。構(gòu)建單鏈抗體表達(dá)載體,經(jīng)過(guò)原核表達(dá)得到了可溶性表達(dá)的目的蛋白。SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)表明表達(dá)的單鏈抗體分子量為28 kD。用Ni-NTA金屬親和層析法對(duì)可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,得到的目的蛋白純度為74.8%,ELISA檢測(cè)表明該scFv能夠與對(duì)硫磷特異性結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步制備高特異性、高親和力抗體奠定了基礎(chǔ),并且為基因工程抗體在農(nóng)藥檢測(cè)方面的應(yīng)用提供依據(jù)。 以分泌抗微囊藻毒素MC-LR單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞為材料,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出抗體的重鏈和輕鏈全編碼區(qū)cDNA序列。序列分析表明,PCR得到的抗體重鏈序列共1473bp,包括部分VH,完整的CH1、CH2、CH3三個(gè)恒定區(qū)和3’端非編碼區(qū),其中VH大小為363bp,編碼121個(gè)氨基酸,屬小鼠IgH-V7183 VH5家族;得到的輕鏈序列共880bp,包括部分輕鏈可變區(qū)VL,完整的恒定區(qū)和3’非編碼區(qū),其中VL大小為336bp,編碼112個(gè)氨基酸,屬小鼠IGKV21亞組。VH和VL符合小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因特征,均含有4個(gè)框架區(qū)、3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)及抗體特征性的2個(gè)半胱氨酸殘基,且基因內(nèi)無(wú)終止密碼子,表明得到的序列為小鼠抗體重鏈和輕鏈基因序列。 分別擴(kuò)增VH和VL,通過(guò)重疊延伸PCR將二者拼接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-mc。序列分析表明,該scFv基因全長(zhǎng)744bp,編碼248個(gè)氨基酸。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami 2(DE3)進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析,單鏈抗體主要以包涵體的形式在大腸桿菌中表達(dá)。在IPTG為0.1 mM,培養(yǎng)溫度為15℃時(shí)可溶性表達(dá)產(chǎn)物含量最高。利用Ni-NTA對(duì)可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,回收到的目的蛋白濃度為0.115 mg/ml。ELISA檢測(cè)表明該單鏈抗體能與MC-LR發(fā)生特異性結(jié)合。 為提高單鏈抗體的親和力,利用核心鏈霉親和素的四聚化特性對(duì)scFv進(jìn)行多聚化。將scFv基因與核心鏈霉親和素基因拼接,并構(gòu)建四價(jià)抗體表達(dá)載體pET-teab。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析,四價(jià)抗體主要以不溶性的包涵體的形式表達(dá)。在IPTG為0.1 mM,培養(yǎng)溫度為15℃時(shí)可溶性表達(dá)產(chǎn)物含量最高。利用Ni-NTA對(duì)可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,回收到的目的蛋白濃度為0.179 mg/ml。非還原性SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)表明,回收的目的蛋白以四聚體和單體的形式存在,沒(méi)有檢測(cè)到比四聚體分子量大的分子。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,四價(jià)抗體與單鏈抗體和單克隆抗體相比,具有更高的親和力。
[Abstract]:The preparation of monoclonal antibodies against small molecule hapten is usually complicated, and in many cases, the antibodies obtained have poor affinity and low titer, which can not meet the requirements of being used as detective antibodies. To a great extent, the application of monoclonal antibodies is limited. In this study, single chain antibodies against parathion were prepared to explore the semi-antibodies against known genes. At the same time, the single chain antibody against microcystin-LR (MC-LR) of unknown antibody gene was constructed by genetic engineering method. On this basis, the tetravalent antibody was constructed, which laid a foundation for the application of genetic engineering antibody in the detection of small molecule hapten substances.
Referring to the sequence of parathion antibody published in GenBank, 45 nucleotides were added between heavy chain V-region (VH) and light chain V-region (VL) genes as ligation peptides. The expression vector of single-chain antibody was constructed and soluble after prokaryotic expression. SDS-PAGE and Western Blot assays showed that the molecular weight of the expressed scFv was 28 kD. The purity of the soluble protein was 74.8% by Ni-NTA affinity chromatography. ELISA assay showed that the scFv could specifically bind to parathion. The high affinity antibody laid the foundation for the application of genetic engineering antibody in pesticide detection.
Hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against microcystin MC-LR were used to amplify the full-coding region of the heavy chain and light chain of the antibody by RT-PCR. Sequence analysis showed that the heavy chain sequence of the antibody obtained by PCR was 1473 bp, including some VH, complete CH1, CH2 and CH3 constant regions and 3'-terminal non-coding regions, of which VH was 363 BP in size. It encodes 121 amino acids and belongs to the murine IgH-V7183 VH5 family. The obtained light-chain sequences consist of 880 bp, including partial light-chain variable region VL, complete constant region and 3'non-coding region, of which VL is 336 BP in size and encodes 112 amino acids, belonging to the murine IGKV21 subgroup. The two cysteine residues in the complementary determinant region of antigen and the characteristic antibody, and no termination codon in the gene, indicated that the obtained sequence was the heavy chain and light chain gene sequence of mouse antibody.
Prokaryotic expression vector pET-mc was constructed by splicing VH and VL, respectively. Sequence analysis showed that the scFv gene was 744 BP in length and encoded 248 amino acids. The expression vector was transformed into E. coli Origami 2 (DE3) to induce the expression of the target protein. SDS-PAGE and Western Blot analysis showed that the single chain antibody was mainly an inclusion body. When IPTG was 0.1 mM and culture temperature was 15 C, the soluble expression product was the highest. The soluble expression product was purified by Ni-NTA and the concentration of the recovered protein was 0.115 mg/ml. ELISA detection showed that the SCFv could bind specifically to MC-LR.
In order to improve the affinity of scFv, scFv was polymerized by tetramerization of core streptavidin. The scFv gene was spliced with core streptavidin gene and a tetravalent antibody expression vector pET-teab was constructed. The soluble protein was purified by Ni-NTA and the concentration of the recovered protein was 0.179 mg/ml. The results of non-reducing SDS-PAGE and Western Blot showed that the recovered protein existed in the form of tetramers and monomers, and the molecular weight of the recovered protein was not larger than that of tetramers. Molecular. ELISA results showed that tetravalent antibodies had higher affinity than single chain antibodies and monoclonal antibodies.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 亢世榮;;藥用炭胃管高位清潔灌腸在有機(jī)磷中毒救治中的療效觀察[J];護(hù)理研究;2011年27期

2 王希堯;田春蓮;鄢景森;賀鳳偉;趙春杰;;GC測(cè)定細(xì)辛藥材中的農(nóng)藥殘留量[J];中國(guó)藥房;2011年31期

3 孔建春;;有機(jī)磷農(nóng)藥中毒72例的救治體會(huì)[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2010年17期

4 陳新躍;徐莉;杜娟;呂超;張子前;周亞紅;祁康泰;;檢測(cè)急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒患兒血清NSE的臨床意義[J];東南國(guó)防醫(yī)藥;2011年04期

5 馬桂瑞;;急性有機(jī)磷中毒特級(jí)護(hù)理心得[J];醫(yī)學(xué)信息(上旬刊);2011年06期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳華;林祥吉;家梨;謝建忠;志紅;;山仔水華微囊藻毒素的體外免疫毒性研究[A];經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)年會(huì)（第三卷）[C];2010年

2 甘南琴;肖艷;劉津;宋立榮;;微囊藻毒素功能新探:微囊藻毒素在微囊藻群體維持中的作用及機(jī)制[A];中國(guó)藻類(lèi)學(xué)會(huì)第八次會(huì)員代表大會(huì)暨第十六次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2011年

3 季穎;;微囊藻毒素的化學(xué)藥劑氧化去除方法研究[A];二氧化氯研究與應(yīng)用--2010二氧化氯與水處理技術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

4 蒲朝文;封雷;李恒;;魚(yú)、鴨樣品中微囊藻毒素含量測(cè)定方法研究[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)2010年論文集[C];2011年

5 李錚;杜克久;傅珊;趙興茹;李科;;高效液相色譜法測(cè)定天然水體中微囊藻毒素方法優(yōu)化[A];第六屆全國(guó)環(huán)境化學(xué)大會(huì)暨環(huán)境科學(xué)儀器與分析儀器展覽會(huì)摘要集[C];2011年

6 楊濤;陳華;;微囊藻毒素污染現(xiàn)狀及其生殖發(fā)育危害[A];經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)年會(huì)（第三卷）[C];2010年

7 曹瑩;張亞輝;劉征濤;;水環(huán)境中微囊藻毒素分析方法的研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)環(huán)境與生態(tài)毒理學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第二屆學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)與基準(zhǔn)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2011年學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文集[C];2011年

8 張仁平;舒為群;蒲朝文;封雷;李恒;喻珊;;不同水體富營(yíng)養(yǎng)化程度與水中魚(yú)鴨體內(nèi)微囊藻毒素相關(guān)分析[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)2010年論文集[C];2011年

9 陸開(kāi)宏;金春華;盤(pán)家永;潘潔慧;朱津永;;微囊藻毒素在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的積累和降解[A];中國(guó)海洋湖沼學(xué)會(huì)藻類(lèi)學(xué)分會(huì)第七屆會(huì)員大會(huì)暨第十四次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2007年

10 陳加平;徐立紅;;微囊藻毒素LR對(duì)大鼠肝細(xì)胞p53、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[A];中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)抗誘變劑和抗癌劑專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第三次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議、中國(guó)毒理學(xué)會(huì)生化與分子毒理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第五屆學(xué)術(shù)交流會(huì)、貴州省環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)成立大會(huì)暨首屆學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 李兵;揭開(kāi)微囊藻毒素致肝癌之謎[N];健康報(bào);2003年

2 姜澎;水污染致癌之謎解開(kāi)[N];文匯報(bào);2003年

3 趙洪森;巧治梨潛皮蛾[N];山西科技報(bào);2001年

4 趙紅梅;5種高毒有機(jī)磷農(nóng)藥將被禁[N];河北日?qǐng)?bào);2006年

5 山居;四市共建水質(zhì)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)平臺(tái)[N];無(wú)錫日?qǐng)?bào);2009年

6 王啟;急性農(nóng)藥中毒急救方法[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2008年

7 本報(bào)記者 王愛(ài)娥;高毒農(nóng)藥能否按期禁用今年最關(guān)鍵[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2006年

8 牛牧;高毒殺蟲(chóng)劑替代有序推進(jìn)[N];中國(guó)化工報(bào);2006年

9 記者 王愛(ài)娥;出口退稅率下調(diào)對(duì)農(nóng)藥出口影響不大[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2006年

10 本版編輯 宗禾 一帆 宗明;高毒農(nóng)藥大限已到[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 胡志堅(jiān);微囊藻毒素毒性及其致癌機(jī)制[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

2 宋麗敏;小分子半抗原多價(jià)抗體的制備及其活性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

3 溫若冰;噬菌體展示技術(shù)篩選藻毒素結(jié)合多肽、毒素調(diào)查及甲藻鈣調(diào)蛋白基因的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2011年

4 吳明松;二氧化氯對(duì)水中微囊藻毒素和隱孢子蟲(chóng)卵囊的去除效能研究及毒副作用探討[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2011年

5 孟冠敏;微囊藻毒素LR對(duì)PC12細(xì)胞的毒性及作用機(jī)制[D];浙江大學(xué);2011年

6 張杭君;微囊藻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究[D];浙江大學(xué);2006年

7 孫瑜;微囊藻毒素LR對(duì)肝細(xì)胞系HL7702內(nèi)的蛋白磷酸酶PP2A下游靶點(diǎn)的影響[D];浙江大學(xué);2012年

8 馮小剛;環(huán)境中微囊藻毒素的檢測(cè)、提純及其紫外光助催化降解的研究[D];東南大學(xué);2006年

9 尹黎燕;微囊藻毒素對(duì)高等植物的生態(tài)生理學(xué)效應(yīng)研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2005年

10 李莉;微囊藻毒素對(duì)濾食性魚(yú)類(lèi)影響的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和野外研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 史艷芳;對(duì)硫磷降解菌的分離篩選及提高其降解作用研究[D];東北大學(xué);2008年

2 楊振宇;水和水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測(cè)方法研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

3 張春景;微囊藻毒素對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝組織的毒理效應(yīng)[D];寧波大學(xué);2009年

4 婁鵬飛;微囊藻毒素提取物與水生細(xì)菌的相互作用[D];華中師范大學(xué);2011年

5 于秋香;對(duì)硫磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

6 李月秋;高毒有機(jī)磷農(nóng)藥及殘留的毛細(xì)管電泳檢測(cè)與柱上富集研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

7 尹玉芬;一株太湖土著細(xì)菌對(duì)微囊藻毒素生物降解的初步研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 常晶;紫外/臭氧去除水中微囊藻毒素的效能及氧化產(chǎn)物研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2010年

9 呂學(xué)東;大米中對(duì)硫磷殘留量免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

10 張愛(ài);微囊藻毒素-LR酶聯(lián)免疫法的開(kāi)發(fā)研究[D];云南大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2229851