發(fā)布時(shí)間：2018-09-07 14:34

【摘要】： 論文Ⅰ脂聯(lián)素受體在血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)的研究 近年來(lái)的研究表明脂肪組織是高度活躍的內(nèi)分泌器官,脂肪細(xì)胞分泌的產(chǎn)物稱(chēng)之為“脂肪因子”,主要包括:脂聯(lián)素(adiponectin,APN),瘦素(leptin),抗素(resistin),腫瘤壞死因子(TNFα)等。目前,在脂肪細(xì)胞因子的研究中,發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素是體內(nèi)最重要的保護(hù)性的脂肪因子,脂聯(lián)素降低與糖尿病、代謝綜合征和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。深入探討脂聯(lián)素的作用及機(jī)制,為防治代謝疾病及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展具有重要的理論和臨床意義。 既往認(rèn)為,血管外膜的功能是對(duì)血管起保護(hù)、支撐和營(yíng)養(yǎng)作用。近年的研究發(fā)現(xiàn),外膜還可以分泌多種血管活性物質(zhì),以旁分泌的方式調(diào)節(jié)血管的舒縮功能及結(jié)構(gòu)變化。外膜中的主要細(xì)胞成分是成纖維細(xì)胞。外膜成纖維細(xì)胞具有旁分泌/自分泌功能,可分泌多種生物活性因子如生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(AB)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、白介素-1、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、MMP等,對(duì)動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)發(fā)生來(lái)自血管內(nèi)的損傷病變?nèi)缪軘U(kuò)張、內(nèi)皮剝脫、高脂血癥或來(lái)自血管外的損傷如外膜剝離、滋養(yǎng)血供受阻時(shí),外膜中成纖維細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多,成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,進(jìn)而引起組織修復(fù)和血管重塑。在損傷全過(guò)程中,外膜細(xì)胞增殖活性大于中層細(xì)胞,外膜成纖維細(xì)胞出現(xiàn)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)表達(dá),提示表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。 雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)脂聯(lián)素的研究甚多,但是脂聯(lián)素與血管外膜的關(guān)系尚未完全明了。脂聯(lián)素的作用是通過(guò)脂聯(lián)素受體Adipo R1和Adipo R2介導(dǎo)的。血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞上是否存在脂聯(lián)素受體,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道�；谝陨蠁�(wèn)題,構(gòu)成了本研究的思路。本研究的目的:1探討脂聯(lián)素受體在血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞上的表達(dá)情況;2在炎癥狀態(tài)下,血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素受體的變化。通過(guò)這一研究,為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素通過(guò)血管外膜發(fā)揮抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用奠定基礎(chǔ)。 方法 1細(xì)胞培養(yǎng):剝脫小鼠胸主動(dòng)脈的外膜,用組織貼塊法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),當(dāng)達(dá)到80-90融合時(shí)傳代,實(shí)驗(yàn)采用第4-8代細(xì)胞。分別用α-SM-actin單抗(1:200)和波形蛋白(Vimentin)單抗(1:300)和二抗TRITC(1:100)進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色,鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否是所需要的AF及其純度。 2實(shí)驗(yàn)分組: (1)根據(jù)LPS的刺激濃度分組 為了觀察不同濃度梯度LPS刺激情況下血管外膜成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體的表達(dá)的變化,按照LPS的濃度分為5個(gè)組:1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,50μg/ml和PBS對(duì)照組。 (2)根據(jù)LPS的不同刺激時(shí)間分組 為了觀察不同作用時(shí)間LPS刺激情況下血管外膜成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體的表達(dá)的變化,按照LPS 10μg/ml的不同刺激時(shí)間分為6個(gè)組:0hr,1hr,6hr,12hr,24hr,48hr。 3 RT-PCR:觀察正常血管外膜組織、骨骼肌組織及肝組織脂聯(lián)素受體的表達(dá)及正常及LPS刺激后,血管外膜成纖維細(xì)胞(AFs)上AdipoR1及AdipoR2的表達(dá),采用“2~(-ΔΔCT)方法”分析基因的表達(dá)量。 4蛋白印跡分析:觀察正常血管外膜組織、骨骼肌組織及肝組織脂聯(lián)素受體的表達(dá)及正常及LPS刺激后,AFs上AdipoR1及AdipoR2的表達(dá)。強(qiáng)弱用表達(dá)的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。 5免疫細(xì)胞熒光染色:觀察正常及LPS刺激后,FITC和TRITC二抗標(biāo)記的α-SM-actin、vimentin、AdipoR1及AdipoR2在AF中的表達(dá),用IOD比較它們?cè)诓煌纸M間表達(dá)的強(qiáng)弱。 結(jié)果 1 AF的孵育和鑒定: 組織貼塊法培養(yǎng)血管外膜細(xì)胞,4-7d后有細(xì)胞從組織塊邊緣游出、貼壁生長(zhǎng)。10%FBS的DMEM中培養(yǎng)7-10d后出現(xiàn)第一次細(xì)胞融合。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%-90%融合時(shí),進(jìn)行傳代,第4-8代用于不同的試驗(yàn).經(jīng)免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法顯示所有培養(yǎng)細(xì)胞的。α-SM-actin單抗染色陰性,所有培養(yǎng)細(xì)胞的波形蛋白(Vimentin)單抗染色陽(yáng)性,說(shuō)明培養(yǎng)的AF純度達(dá)到100%。 2脂聯(lián)素和脂聯(lián)素受體的表達(dá): AdipoR1在血管外膜組織及血管外膜成纖維細(xì)胞上mRNA和蛋白水平均高表達(dá)。與骨骼肌組織相比,脂聯(lián)素受體1 mRNA在大鼠血管外膜組織中的表達(dá)約占85%(mRNA:血管外膜:10.79±8.84 vs骨骼肌:14.65±13.54;蛋白質(zhì):血管外膜:1.96±1.12 vs骨骼肌:1.69±0.82,P＞0.05)。AdipoR2在血管外膜組織及血管外膜成纖維細(xì)胞上mRNA和蛋白水平上均低表達(dá)。與肝組織相比約占5%(mRNA:血管外膜:5.72±3.90 vs肝臟:36.67±15.28;蛋白質(zhì):血管外膜:0.0059±0.0002 vs肝臟:0.6653±0.0270,P＜0.01)。沒(méi)有檢測(cè)到脂聯(lián)素mRNA在血管外膜成纖維細(xì)胞上的表達(dá)。 3 LPS刺激下脂聯(lián)素受體1的表達(dá): 不同LPS濃度刺激下,AdipoR1的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)在1μg/ml時(shí)略有升高(mRNA:1μg/ml:18.433±5.982 vs對(duì)照:20.030±3.313;蛋白質(zhì):1μg/ml:2.686±0.141 vs對(duì)照:2.637±0.256,P＞0.05);5,10,50μg/mlLPS刺激時(shí),AdipoR1的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)逐漸降低,在50μg/ml濃度點(diǎn)時(shí)達(dá)最低谷(mRNA:50μg/ml:18.433±5.982 vs 0.013±0.001;蛋白質(zhì):50μg/ml:0.001±0.001 vs 2.637±0.256,P＜0.01)。 在10μg/mlLPS刺激下,AdipoR1的mRNA在刺激1小時(shí)時(shí)表達(dá)略有升高(mRNA:1h:13.736±4.676 vs對(duì)照:10.793±5.102;P＞0.05);6,12,24,48小時(shí)時(shí),AdipoR1 mRNA的表達(dá)逐漸降低,在48小時(shí)時(shí)達(dá)最低值(mRNA:48h:0.063±0.044 vs對(duì)照:10.793±5.102,P＜0.01)。在1,6,12,24,48小時(shí)時(shí),AdipoR1蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸降低,在48小時(shí)時(shí)達(dá)最低值(蛋白質(zhì):48h:6.990±0.150 vs對(duì)照:0.001±0.001,P＜0.01)。 創(chuàng)新性及局限性 1.創(chuàng)新點(diǎn) (1)應(yīng)用RT-PCR、western blot及免疫細(xì)胞熒光等多種方法證實(shí)了血管外膜成纖維細(xì)胞上存在著脂聯(lián)素受體,尤其是脂聯(lián)素受體1,在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。 (2)在LPS刺激下,血管外膜成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體1表達(dá)降低,呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。 2.局限性 (1)因技術(shù)所限,未能對(duì)脂聯(lián)素受體進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。 (2)未對(duì)脂聯(lián)素受體在炎癥刺激下表達(dá)降低的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。 結(jié)論 (1)正常血管外膜及血管外膜成纖維細(xì)胞可以表達(dá)脂聯(lián)素受體,其中脂聯(lián)素受體1高表達(dá),脂聯(lián)素受體2低表達(dá),而血管外膜成纖維細(xì)胞幾乎不表達(dá)脂聯(lián)素。提示脂聯(lián)素可能通過(guò)旁分泌途徑作用于血管外膜成纖維細(xì)胞。 (2)血管外膜成纖維細(xì)胞脂聯(lián)素受體1的表達(dá)量與LPS刺激濃度和時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。 論文Ⅱ脂聯(lián)素抑制脂多糖介導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和肌化的研究 背景 越來(lái)越多的研究表明,脂聯(lián)素能夠減少脂質(zhì)斑塊的面積,抑制新生內(nèi)膜的增厚及平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移,抑制血管粘附分子的表達(dá)。通過(guò)這些作用,發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)。 血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosderosis,As)發(fā)病的始動(dòng)因素,外膜一直被認(rèn)為在AS的發(fā)生中只是一個(gè)旁觀者。近期的研究得出了不同結(jié)論,發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈外膜炎癥與AS的發(fā)生相關(guān),在AS發(fā)生的早期外膜炎癥即被激活,且炎癥程度與血管病變的嚴(yán)重程度之間呈正相關(guān),外膜套管、埋置內(nèi)毒素浸泡的絲線等可誘導(dǎo)內(nèi)膜增生性病變形成。這些研究結(jié)果提示血管外膜參與了內(nèi)膜病變的形成,但機(jī)制尚不清楚。 已知氧化應(yīng)激是AS發(fā)生的主要機(jī)制之一,可由氧化酶活性升高和(或)抗氧化酶活性降低導(dǎo)致。氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧(reactive oxygen species,ROS)可通過(guò)兩條途徑參與As的發(fā)生發(fā)展:一是對(duì)血管細(xì)胞的直接損傷:另外可作為細(xì)胞內(nèi)第二信使,誘導(dǎo)與AS發(fā)生相關(guān)的炎性細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá),參與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、遷移的調(diào)節(jié)。大量的一氧化氮與生物體內(nèi)的氧氣或超氧陰離子可迅速合成過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO~-),從而使NO形成強(qiáng)細(xì)胞毒性物質(zhì),啟動(dòng)氮氧化應(yīng)激,造成細(xì)胞凋亡和組織損傷。定位于第17對(duì)常染色體上的Ⅱ型NOS稱(chēng)為誘導(dǎo)型(iNOS),只在細(xì)胞受到炎性因子等刺激被激活后才明顯表達(dá)。iNOS產(chǎn)生的大量的一氧化氮與生物體內(nèi)的氧氣或超氧陰離子可迅速合成過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO~-),從而使NO形成強(qiáng)細(xì)胞毒性物質(zhì),造成細(xì)胞凋亡和組織損傷。大量的研究已經(jīng)表明脂蛋白過(guò)氧化和心血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受損是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因,而內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的ONOO-正是使脂蛋白過(guò)氧化和內(nèi)皮細(xì)胞膜受損的主要物質(zhì)。外膜成纖維細(xì)胞具有獨(dú)立的NOS/NO系統(tǒng),可生成NO。在正常情況下成纖維細(xì)胞iNOS低表達(dá),生成少量的NO,但在受到細(xì)菌脂多糖(LPS)和細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等刺激時(shí),體外培養(yǎng)的血管成纖維細(xì)胞可強(qiáng)烈表達(dá)iNOs mRNA,iNOs蛋白合成及NO生成顯著增加,表明血管外膜是血管壁NO的重要來(lái)源之一。 雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)脂聯(lián)素的研究甚多,但是脂聯(lián)素與血管外膜的關(guān)系尚未完全明了。血管外膜周?chē)哂胸S富的脂肪組織,這些組織可能分泌脂聯(lián)素直接作用于鄰近的血管外膜,局部分泌脂聯(lián)素能否作用于血管外膜發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用、如何通過(guò)血管外膜對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展,這些問(wèn)題目前尚未完全明了。我們的前期研究表明,動(dòng)脈粥樣硬化病變血管內(nèi)膜或外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后,斑塊的面積縮小,同時(shí),血清脂聯(lián)素濃度明顯升高。脂聯(lián)素可通過(guò)抑制血管壁黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。但脂聯(lián)素能否通過(guò)影響iNOS發(fā)揮作用及其機(jī)制尚不明了。 基于以上問(wèn)題,構(gòu)成了本研究的思路。本研究目的:1探討脂聯(lián)素對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞遷移、增殖及肌化的影響;2探討脂聯(lián)素對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞iNOS、ONOO~-及NO的影響;3探討脂聯(lián)素發(fā)揮上述作用的可能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究結(jié)果將為更深入地研究脂聯(lián)素對(duì)血管的作用途徑和作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。 方法 1體內(nèi)實(shí)驗(yàn): 1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn): 90只10-12周齡的雄性apoE~(-/-)小鼠實(shí)驗(yàn)全程高脂飲食(含0.25%膽固醇和15%脂肪)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組:外膜局部轉(zhuǎn)染脂聯(lián)素腺病毒載體(Ad-APN)組,外膜局部轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白腺病毒載體(Ad-GFP)組和生理鹽水對(duì)照組,每組30只。全部實(shí)驗(yàn)鼠均于實(shí)驗(yàn)初行左頸總動(dòng)脈套管(縮窄性硅膠管)術(shù)以誘發(fā)AS病變。外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN組于頸動(dòng)脈套管手術(shù)4周后取出套管并外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN。外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP組于頸動(dòng)脈套管手術(shù)4周后取出套管并外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP。對(duì)照組于頸動(dòng)脈套管手術(shù)4周后取出套管并外膜局部轉(zhuǎn)染生理鹽水。 1.2血清脂聯(lián)素濃度分析:利用大鼠抗人脂聯(lián)素ELISA試劑盒分析高脂飼料apoE~(-/-)小鼠轉(zhuǎn)染腺病毒前后血清脂聯(lián)素濃度。 1.3 AS斑塊的超聲影像學(xué)形態(tài)特征:應(yīng)用顯微超聲技術(shù)測(cè)量斑塊面積。 1.4生化指標(biāo)檢測(cè):取實(shí)驗(yàn)前后全部動(dòng)物眼球后采血,測(cè)定血脂濃度。 1.5一氧化氮生成檢測(cè):取實(shí)驗(yàn)前后全部動(dòng)物眼球后采血,測(cè)定血清中一氧化氮濃度。 1.6病理學(xué)檢測(cè):頸動(dòng)脈斑塊組織學(xué)切片分別行蘇木素一伊紅染色,免疫組織化學(xué)染色觀察iNOS和ONOO-的局部表達(dá)。 2體外實(shí)驗(yàn): 2.1細(xì)胞培養(yǎng):同論文Ⅰ。 2.2實(shí)驗(yàn)分組 2.2.1根據(jù)APN的刺激濃度分組 為了觀察不同作用時(shí)間及不同濃度梯度APN刺激情況下,血管外膜成纖維細(xì)胞功能的變化,按照APN的作用濃度分為4個(gè)組:3μg/ml APN+LPS 10μg/ml刺激組,10μg/ml APN+LPS 10μg/ml刺激組,30μg/ml APN+LPS 10μg/ml刺激組,無(wú)APN+LPS 10μg/ml對(duì)照組。根據(jù)APN不同作用時(shí)間分為6個(gè)組:LPS 10μg/ml對(duì)照組,APN刺激1/2小時(shí)組,APN刺激2小時(shí)組,APN刺激6小時(shí)組,APN刺激12小時(shí)組,APN刺激24小時(shí)組。 2.2.2根據(jù)有無(wú)siRNA-AdipoR1轉(zhuǎn)染及AMPK抑制劑分組 為了觀察APN和LPS對(duì)AF功能和相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響,按照有無(wú)siRNA-AdipoR1轉(zhuǎn)染及AMPK抑制劑刺激將AF分為6個(gè)組:10μg/mlAPN+LPS 10μg/ml組,siRNA-AdipoR1+10μg/mlAPN+LPS 10μg/ml組,non-sensesiRNA+10μg/ml APN+LPS 10μg/ml對(duì)照組,Compound C+10μg/mlAPN+LPS 10μg/ml組,10μg/ml APN組和LPS 10μg/ml對(duì)照組。 2.3 siRNA干擾AF AdipoR1蛋白表達(dá)的檢測(cè):western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞β-actin,AdipoR1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 2.4 MTT試驗(yàn):觀察APN和LPS刺激后,AF在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖能力。 2.5劃痕法和transwell法:觀察APN和LPS刺激后,AF在不同時(shí)間點(diǎn)的遷移能力。 2.6一氧化氮生成檢測(cè):觀察APN和LPS刺激后,AF生成一氧化氮的變化。 2.7 RT-PCR:觀察APN和LPS刺激后,iNOS和β-actin的表達(dá),采用“2~(-ΔΔCT)方法”分析基因的表達(dá)量。 2.8蛋白印跡分析:觀察APN和LPS刺激后,iNOS、nitrotyrosine、p-AMPK、p-ACC和β-actin的表達(dá)。強(qiáng)弱用表達(dá)的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。 2.9免疫細(xì)胞熒光染色:觀察APN和LPS刺激后,FITC和TRITC二抗標(biāo)記的α-SM-actin在AF中的表達(dá),用IOD比較它們?cè)诓煌纸M間表達(dá)的強(qiáng)弱。 結(jié)果 1體內(nèi)試驗(yàn) 1.1動(dòng)物的基本特征 外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN組,外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-βgal組各有1只動(dòng)物于首次左頸總動(dòng)脈套管后死亡,其余動(dòng)物全部完成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)初動(dòng)物各組間體重?zé)o明顯差異。8周時(shí),Ad-APN組小鼠體重較對(duì)照組及Ad-βgal組明顯下降(27.35±1.26vs 31.44±1.24g;27.35±1.26 vs 30.75±1.21g,P均＜0.01)。 1.2血清脂聯(lián)素濃度 ApoE敲基因小鼠高脂喂養(yǎng)8周后,血清脂聯(lián)素明顯降低(P＜0.01)。與轉(zhuǎn)染前比較,外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后,血清脂聯(lián)素濃度增加約8倍(P＜0.01)。與外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP比較,血管局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后,血清脂聯(lián)素濃度增加約9倍(P＜0.01)。 1.3 AS斑塊影像學(xué)特征 血管外膜轉(zhuǎn)染Ad-APN與轉(zhuǎn)染前相比,斑塊面積明顯縮小達(dá)26.72%(P＜0.01),與外膜轉(zhuǎn)染Ad-GFP相比斑塊面積縮小24.53%(P＜0.01)。 1.4脂聯(lián)素對(duì)血脂的影響 各組間套管前血清總膽固醇、甘油三酯、高密度膽固醇和低密度膽固醇濃度均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。與轉(zhuǎn)染前比較,外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后,血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白濃度明顯降低(P均＜0.01),高密度脂蛋白濃度明顯升高(P＜0.01)。與外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP比較,外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后,血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白濃度明顯降低(P均＜0.01),高密度脂蛋白濃度明顯升高(P＜0.01)。 1.5脂聯(lián)素對(duì)血清NO的影響 與轉(zhuǎn)染前和外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP比較,NO濃度明顯降低(P均＜0.01)。 1.6脂聯(lián)素對(duì)血管壁iNOS和ONOO-的影響 與轉(zhuǎn)染前和外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-GFP比較,iNOS和ONOO-的表達(dá)明顯降低(P均＜0.01)。 2體外實(shí)驗(yàn) 2.1 AF的孵育和鑒定:同論文Ⅰ。 2.2 siRNA干擾AF AdipoR1蛋白表達(dá)的效果 應(yīng)用不同濃度siRNA-AdipoR1轉(zhuǎn)染AF進(jìn)行RNAi,western blot檢測(cè)AdipoR1的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染濃度(50,100,200,250pmol/L)的增加逐漸減低(P均＜0.01),而β-actin的表達(dá)不受影響。 2.3 APN和LPS對(duì)AF增殖的影響 (1)LPS對(duì)AF增殖的影響:通過(guò)MTT試驗(yàn)證實(shí),與正常細(xì)胞對(duì)照組相比,LPS促進(jìn)AF的增殖(P＜0.01)。 (2)APN對(duì)AF增殖的影響:通過(guò)MIT試驗(yàn)進(jìn)行OD值的比較,APN不影響正常AF細(xì)胞的增殖能力(P＞0.05)。與LPS組相比,APN+LPS組OD值下降(P＜0.01)。與APN+LPS組相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+APN+LPS組OD值升高(P均＜0.01)。 2.4 APN和LPS對(duì)AF遷移的影響 (1)LPS對(duì)AF遷移的影響:劃痕實(shí)驗(yàn)顯示隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng),LPS導(dǎo)致的AF的遷移能力逐漸增加。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)類(lèi)似,隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng),穿過(guò)transwell膜的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。 (2)APN對(duì)AF遷移的影響:與LPS組相比,APN+LPS組AF遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.01)。與APN+LPS組相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS組和CompoundC+APN+LPS組AF遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)增加(P均＜0.01)。 2.5 APN和LPS對(duì)AF向MF轉(zhuǎn)化的影響 (1)LPS對(duì)AF向MF轉(zhuǎn)化的影響:與正常細(xì)胞相比,LPS導(dǎo)致AFα-SM-actin單抗染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)逐步增加(P＜0.01)。 (2)APN對(duì)AF向MF轉(zhuǎn)化的影響:與LPS組相比,APN+LPS組AFα-SM-actin單抗染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.01)。與APN+LPS組相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+APN+LPS組AFα-SM-actin單抗染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)增加(P均＜0.01)。 2.6 APN和LPS對(duì)AF一氧化氮生成的影響 (1)LPS對(duì)AF一氧化氮的影響:正常情況下,AF產(chǎn)生少量的一氧化氮;加入LPS刺激后,AF一氧化氮的產(chǎn)生增加(P＜0.01)。 (2)APN對(duì)AF一氧化氮的影響:與LPS組相比,APN+LPS組AF產(chǎn)生的NO減少(P＜0.01)。在脂聯(lián)素刺激濃度分別在3,10,30μg/ml時(shí),一氧化氮的生成量以10μg/ml時(shí)降至最低;脂聯(lián)素10μg/ml分別刺激1/2,1,2,6,12,24,48小時(shí)時(shí),一氧化氮的生成量在2小時(shí)時(shí)達(dá)最低,而后隨著APN作用時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢升高。與APN+LPS組相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+APN+LPS組AF產(chǎn)生的一氧化氮增加(P均＜0.01)。 2.7 APN和LPS對(duì)AF iNOS和ONOO-表達(dá)的影響: 與LPS組相比,APN+LPS組AFiNOS和ONOO-的表達(dá)降低(P均＜0.01)。與APN+LPS組相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS組.和Compound C+APN+LPS組AFiNOS和ONOO-的表達(dá)升高(P均＜0.01)。 2.8 AF一氧化氮產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通路的影響: 與LPS組相比,APN+LPS組和APN組AF的p-AMPK和p-ACC的表達(dá)增加(P均＜0.01)。與APN+LPS組相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+APN+LPS組AF的p-AMPK和p-ACC的表達(dá)降低(P均＜0.01)。 結(jié)論 1血管外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后血清血脂水平下降,體重減輕,說(shuō)明脂聯(lián)素可通過(guò)外膜局部干預(yù)發(fā)揮改善代謝的作用。 2血管外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后,血清過(guò)度增高的NO濃度明顯下降,血管壁iNOS和ONOO-表達(dá)降低。提示脂聯(lián)素可能通過(guò)抑制iNOS和ONOO-的表達(dá)來(lái)發(fā)揮外膜抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。 3體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),LPS對(duì)AF的遷移、增殖和肌化均有促進(jìn)作用,而APN能夠有效地抑制LPS對(duì)AF的遷移、增殖和肌化的促進(jìn)作用。 4體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS能夠激活A(yù)F的iNOS,使NO和ONOO-產(chǎn)生增加,而APN能夠抑制LPS對(duì)iNOS的影響。 5體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),APN通過(guò)AdipoR1,激活A(yù)MPK通路,抑制iNOS的激活及NO和ONOO-的產(chǎn)生,抑制LPS造成的AF功能變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 阮從瀟;李玉潔;楊慶;陳穎;翁小剛;王嵐;周淑媛;朱曉新;;血管外膜細(xì)胞成分影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展研究概述[J];中國(guó)中藥雜志;2013年06期

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本文編號(hào)：2228545