【摘要】： RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指通過(guò)誘導(dǎo)同源mRNA降解導(dǎo)致特定基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默。目前,RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究和基因治療等領(lǐng)域。RNAi可以通過(guò)siRNA或shRNA來(lái)實(shí)現(xiàn),shRNA普遍應(yīng)用RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄,但此類(lèi)啟動(dòng)子缺乏組織特異性,因此我們選擇RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控shRNA轉(zhuǎn)錄,從而實(shí)現(xiàn)RNAi的組織特異性。本研究采用RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子中的apoA-I啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控shRNA在肝癌細(xì)胞中特異性表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療的肝靶向性。 首先,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增apoA-I基因啟動(dòng)子序列,并將其克隆至pEGFP的報(bào)告蛋白EGFP基因上游,構(gòu)建肝靶向重組載體pAE。將其和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞和非肝癌細(xì)胞,以報(bào)告蛋白的表達(dá)為標(biāo)志檢測(cè)其組織特異性。結(jié)果表明apoA-I啟動(dòng)子能夠特異性啟動(dòng)綠色熒光蛋白在肝癌細(xì)胞中表達(dá),而在食管癌EC9706、乳腺癌MCF7、宮頸癌HeLa細(xì)胞中不表達(dá),apoA-I啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的肝細(xì)胞組織特異性,為肝組織靶向性基因治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 其次,我們將肝特異性apoA-I啟動(dòng)子運(yùn)用到RNAi載體構(gòu)建中,期望實(shí)現(xiàn)肝癌的靶向性基因治療,試驗(yàn)中用報(bào)告蛋白EGFP的表達(dá)下調(diào)情況來(lái)判定載體構(gòu)建是否成功。由于apoA-I啟動(dòng)子屬于PolⅡ啟動(dòng)子,它的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制有別于PolⅢ啟動(dòng)子,所以我們對(duì)shRNA的表達(dá)框進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,添加了Ribozyme和MAZ結(jié)構(gòu),與未經(jīng)修飾的質(zhì)粒載體做對(duì)照,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,以報(bào)告蛋白的表達(dá)為標(biāo)志檢測(cè)其活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的apoA-I啟動(dòng)子調(diào)控的RNAi載體不僅能夠有效實(shí)現(xiàn)RNAi作用,同時(shí)可以有效降低脫靶效應(yīng),為PolⅡ啟動(dòng)子在RNAi中的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 RNAi具有序列特異性的特點(diǎn),因此堿基突變、缺失等都可能對(duì)RNAi效果產(chǎn)生一定的影響。在本研究中,對(duì)于PolⅡ啟動(dòng)子調(diào)控的shRNA序列中堿基缺失對(duì)RNAi效果的影響也進(jìn)行了初步探索,在上步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有RNAi作用的shRNA序列正義鏈3'端設(shè)計(jì)堿基缺失,和未缺失的質(zhì)粒做對(duì)照,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,以報(bào)告蛋白的表達(dá)為標(biāo)志檢測(cè)其活性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PolⅡ啟動(dòng)子調(diào)控的shRNA正義鏈上進(jìn)行堿基缺失,shRNA載體也具有一定的RNAi效果,為深入探索RNAi的干擾機(jī)制進(jìn)行了初步的嘗試。 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一種復(fù)雜的過(guò)程,涉及多種基因、多種因素的綜合作用,因此聯(lián)合基因治療已成為腫瘤基因治療研究的新方向。為了實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的雙基因沉默,并預(yù)防RNAi逃逸,在本研究中,我們構(gòu)建雙基因RNA沉默載體pSAD-EGFP和pDAF-EGFP,共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,以報(bào)告蛋白的表達(dá)為標(biāo)志檢測(cè)其活性,嘗試聯(lián)合RNAi的可行性。結(jié)果顯示兩種質(zhì)粒對(duì)EGFP都具有沉默效果,為腫瘤的聯(lián)合RNAi基因治療奠定了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:RNA interference (RNA interference,RNAi) refers to post-transcriptional gene silencing of specific genes by inducing homologous mRNA degradation. At present, RNAi technology has been widely used in gene function research and gene therapy. RNAi can use RNA polymerase 鈪，

本文編號(hào)：2218200