【摘要】： 酸敏感離子通道(ASICs)是一類胞外質(zhì)子激活的陽(yáng)離子通道,在神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛并具有多種生理病理功能,如參與觸覺、味覺、視覺、痛覺、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶、腦缺血和癲癇等等。ASICs屬于ENaC/DEG家族,與該家族的其他成員一樣,它有兩個(gè)疏水跨膜區(qū),一個(gè)具有很多保守的半胱氨酸的大胞外區(qū),氨基端和羧基端朝向胞內(nèi)側(cè)�，F(xiàn)已克隆得到四個(gè)基因編碼的6個(gè)ASIC亞單位,分別是ASIC1a及其剪接變體ASIC1b,ASIC2a及其剪接變體ASIC2b,ASIC3和ASIC4。中樞神經(jīng)元中主要表達(dá)ASIC1a,2a,2b,其中ASIC1a是主要的功能性亞基,ASIC1a同聚體通道介導(dǎo)一種快速,瞬時(shí)的內(nèi)向電流,通透鈉離子和鈣離子,半最大激活pH值(pH_(0.5))為～6.2。ASIC2a同聚體通道對(duì)質(zhì)子的敏感性很低,pH_(0.5)為～4.4。ASIC2b不能形成功能性同聚體通道,但是可以和其它亞單位裝配在一起,形成具有不同性質(zhì)的異聚體通道。功能性的ASICs通常被認(rèn)為是由相同或不同的亞單位形成的四聚體,然而最近Gouaux等的晶體結(jié)構(gòu)研究表明ASIC1同聚體由三個(gè)亞單位裝配而成。 近來(lái)研究表明ASICs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起很重要的作用,參與突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶和軸突退化等。2002年Welsh實(shí)驗(yàn)室利用ASIC1敲除小鼠發(fā)現(xiàn)ASIC1的缺失可以損傷海馬依賴的LTP,損傷空間記憶和眨眼反射;隨后該小組又發(fā)現(xiàn)ASIC1敲除小鼠對(duì)線索和背景條件性恐懼反應(yīng)有所降低,然而在杏仁核和其他腦區(qū)過(guò)表達(dá)ASIC1,則可以增強(qiáng)背景條件性恐懼。最近海馬腦片上的一項(xiàng)研究表明定位在樹突棘上ASIC1a亞基可以影響樹突棘的密度,抑制ASIC1a的表達(dá)降低樹突棘的數(shù)目,而過(guò)表達(dá)ASIC1a則有相反的作用,其機(jī)制是通過(guò)影響胞內(nèi)Ca~(2+)濃度和CaMKⅡ磷酸化。Friese等(2007)發(fā)現(xiàn)與野生型相比,在ASIC1敲除小鼠中,實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)所產(chǎn)生的臨床缺陷和軸突退化明顯減輕,表明ASIC1參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫炎癥中的軸突退化。 在本論文中,我們研究了活細(xì)胞中酸敏感離子通道的裝配,并且初步探討了酸敏感離子通道在海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育中的作用。 1.用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法研究酸敏感離子通道的裝配 用經(jīng)典的方法如免疫共沉淀或電生理分析,認(rèn)為大多數(shù)亞單位可以形成同聚體或異聚體復(fù)合物,然而關(guān)于活細(xì)胞中ASICs亞單位裝配以及ASICs異聚體中各亞單位分子比的情況并不清楚。在本研究中,我們采用了一種生物物理的方法——熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET),在活細(xì)胞中直接研究ASICs的裝配情況。因?yàn)镕RET技術(shù)具有非侵襲性,可以在活細(xì)胞中分析蛋白—蛋白之間的相互作用,還具有高空間分辨率,被稱為“分子尺”,已經(jīng)被成功應(yīng)用于多種受體和通道的分子比、裝配等研究中。我們將各種ASICs亞單位的羧基端標(biāo)記上CFP和YFP,然后將這些構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中,通過(guò)三通道FRET成像,先計(jì)算FR值,再根據(jù)建立的四聚體或三聚體FRET模型推測(cè)出相鄰亞單位之間的FRET效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不管用四聚體FRET模型,還是用三聚體FRET模型,標(biāo)記了CFP和YFP的同一種亞單位共表達(dá)時(shí)都可以檢測(cè)到顯著的FRET信號(hào),表明ASIC亞單位可裝配成同聚體通道;標(biāo)記了CFP和YFP的不同亞單位共表達(dá)在CHO細(xì)胞中時(shí),也可以檢測(cè)到顯著的FRET信號(hào),表明ASIC亞單位可以裝配成異聚體通道。另外,我們還對(duì)ASIC異聚體的分子比情況進(jìn)行了初步的探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果所形成的ASICs異聚體通道是四聚體,那么每種亞單位有兩個(gè),分子比傾向于2∶2;如果是三聚體,則提示ASICs的裝配是隨意的,分子比是不固定的,2∶1和1∶2這兩種情況都存在。這項(xiàng)研究為ASIC同聚體和異聚體裝配提供了一些新的證據(jù),這種亞單位組成的差異形成了ASICs的功能異質(zhì)性,并很大程度上成為ASICs多樣而復(fù)雜的生理功能的內(nèi)在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 2.酸敏感離子通道在海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育中的作用 樹突的生長(zhǎng)和分支對(duì)功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成非常重要,然而有關(guān)ASICs在樹突發(fā)育中的作用則鮮有報(bào)道。在本研究中,我們?cè)隗w外培養(yǎng)第五天(days in vitro,DIV5)的原代海馬神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染定位在膜上的GFP(F-GFP),隨后加入ASICs拮抗劑抑制ASICs的功能,觀察DIV8和DIV14這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元的樹突生長(zhǎng)、分支復(fù)雜程度,來(lái)研究酸敏感離子通道是否會(huì)影響海馬神經(jīng)元的樹突發(fā)育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)短時(shí)間抑制ASICs的功能并不影響海馬神經(jīng)元的樹突總長(zhǎng)度和分支,而長(zhǎng)時(shí)間抑制ASICs的功能則會(huì)降低樹突總長(zhǎng)度,影響樹突的發(fā)育,表明ASICs參與調(diào)節(jié)樹突的發(fā)育,這將有助于理解酸敏感離子通道如何影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成,并進(jìn)而參與學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)腦功能。
[Abstract]:Acid-sensitive ion channels (ASICs) are a class of extracellular proton-activated cationic channels that are widely distributed in the nervous system and possess various physiological and pathological functions, such as tactile, taste, vision, pain, synaptic plasticity, learning and memory, cerebral ischemia and epilepsy. Six ASIC subunits encoding four genes, ASIC1a and its spliced variants ASIC1b, ASIC2a and their spliced variants ASIC2b, ASIC3 and ASIC4, were cloned and expressed in central neurons. ASIC1a is the main functional subunit. ASIC1a homopolymer channel mediates a fast, instantaneous inward current that permeates sodium and calcium ions. Semi-maximum activation pH (pH_ (0.5)) of ~6.2. ASIC2a homopolymer channel is insensitive to protons, and pH_ (0.5) of ~4.4. ASIC2b does not form a functional homopolymer channel, but can form other channels. Functional ASICCs are generally considered to be tetramers formed by the same or different subunits. However, recent crystal structure studies such as Gouaux have shown that ASIC1 homomers are assembled by three subunits.
Recent studies have shown that ASICs play an important role in the central nervous system, involved in synaptic plasticity, learning and memory, and axonal degeneration. A recent study in the hippocampal slices showed that ASIC1a subunit localized on the dendritic spine can affect the density of the dendritic spine, inhibit the expression of ASIC1a and reduce the number of dendritic spines, while overexpression of ASIC1 in the amygdala and other brain regions can enhance the background-conditioned fear. One year later, the effect was reversed by influencing intracellular Ca ~ (2+) concentration and CaMK II phosphorylation. Friese et al. (2007) found that compared with wild-type mice, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) significantly reduced clinical deficiency and axonal degeneration, suggesting that ASIC1 participated in central nervous system autoimmune inflammation. The axons degenerate.
In this paper, we investigated the assembly of acid-sensitive ion channels in living cells and the role of acid-sensitive ion channels in hippocampal neuronal burst development.
1. to study the assembly of acid sensing ion channels by fluorescence resonance energy transfer (FRET) method.
The classical methods, such as immunoprecipitation or electrophysiological analysis, suggest that most subunits can form homopolymers or heteromeric complexes. However, it is not clear about the ASICs subunit assembly in living cells and the molecular ratio of each subunit in ASICs heteromers. In this study, we used a biophysical method, fluorescence. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) directly studies ASICs assembly in living cells. Because of its non-invasive nature, FRET can analyze protein-protein interactions in living cells and has high spatial resolution, it has been successfully applied in many fields. In the study of receptor-channel molecule ratio and assembly, we labeled CFP and YFP on the carboxyl end of various ASICs subunits, then transfected these constructions into CHO cells. FRET values were calculated by three-channel FRET imaging, and FRET efficiencies between adjacent subunits were deduced from the established tetramer or trimer FRET model. The results showed that significant FRET signals could be detected when the same subunit of CFP and YFP was co-expressed either in the tetramer FRET model or in the trimer FRET model, indicating that ASIC subunits could be assembled into synaptic channels, and significant FRET signals could also be detected when different subunits of CFP and YFP were co-expressed in CHO cells. In addition, the molecule ratio of ASIC heteromers was also preliminarily discussed. It was found that if the ASIC heteromer channel was tetramer, each subunit had two, the molecule ratio tended to be 2:2; if it was trimer, ASICs assembly was random. This study provides some new evidence for ASIC homopolymer and heteromer assembly. This difference in subunit composition forms the functional heterogeneity of ASICs and largely forms the intrinsic structural basis for the diverse and complex physiological functions of ASICs.
2. the role of acid sensing ion channels in the development of dendrites in hippocampal neurons
The growth and branching of dendrites are important for the formation of functional neural networks, but the role of ASICs in tree burst development is rarely reported. Function: To observe the dendritic growth and branching complexity of hippocampal neurons at the time points of DIV8 and DIV14, and to study whether acid-sensitive ion channels affect the dendritic development of hippocampal neurons. ASICs are involved in regulating the development of dendrites, which will help to understand how acid-sensitive ion channels affect the formation of neural networks and thus participate in higher brain functions such as learning and memory.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R33

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本文編號(hào)：2217547