【摘要】： 阿爾茨海默病( Alzheimer’s disease, AD)是一種多發(fā)于老年人群的中樞神經系統退行性疾病,主要臨床特征為記憶衰退、認知及運動功能產生障礙等。隨著全球人口老齡化的加劇,阿爾茨海默病的發(fā)病幾率正在不斷上升,由此引發(fā)的一系列社會問題正在日益加劇。目前對于AD的發(fā)病尚缺乏有效的治療手段,因此研制能夠治療AD的特效藥物具有重要的意義�，F階段關于AD的發(fā)病機理還不十分清楚,其中β樣淀粉蛋白(β-amyloid protein,Aβ)由正常生理狀態(tài)下的可溶性單體形式聚集為具有神經細胞毒性的淀粉樣蛋白沉積被認為是在AD發(fā)病過程中的關鍵事件。有研究表明:Aβ是各種因素引起阿爾茨海默病的共同途徑,是AD發(fā)病和發(fā)展的關鍵因素,因此Aβ被普遍認為是治療AD的有效靶分子。Aβ是由主要存在于腦組織中的β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein ,APP)經過β代謝途徑形成的。一般由39～43個氨基酸組成,具有一個β折疊片層的二級結構,分子整體呈現疏水性,容易聚集,形成不溶性沉積。1999年,Schenk等首次應用Aβ1-42對AD模型小鼠進行主動免疫取得了突破性進展。此后陸續(xù)有研究報道證實Aβ肽段及其抗體可應用于AD的免疫治療,并能夠得到很好的治療效果。由Elan公司研制的Aβ1-42疫苗Betabloc(AN1792)經過I期臨床試驗后,發(fā)現Betabloc能有效的激發(fā)免疫應答,產生與Aβ淀粉樣沉積結合的抗體,能夠有效的激活小膠質細胞清除Aβ淀粉樣沉積形成的斑塊,并且顯著改善患者的認知功能。但遺憾的是,在Ⅱ期臨床實驗過程中,部分患者腦部出現炎癥反應,試驗被迫終止。與此同時對于AD的被動免疫治療方面取得了巨大的進展,研究證實應用抗AβN端抗體可以有效地改善AD的相關癥狀,并且不會引發(fā)Th1細胞的免疫反應。Elan和惠氏公司聯合研制的抗AβN端的人源化抗體Bapineuzumab是第一個開發(fā)用于治療AD的抗體,目前正在進行Ⅲ期臨床試驗。本研究中,我們希望以Aβ1-42及其N端(Aβ1-12、Aβ1-15)為靶標分子通過采用細菌篩選結合固相篩選等多種篩選方案對大容量人源性噬菌體抗體庫進行篩選以獲得特異性抗體,為開發(fā)AD的治療性抗體奠定基礎。 首先,本研究中為了針對Aβ1-12進行抗體篩選以及為篩選獲得的特異性抗體進行初步的表位鑒定提供表位肽段,我們根據Aβ1-42的分子結構及細菌鞭毛表面展示系統的特點,將Aβ1-42分為Aβ1-12、Aβ12-23、Aβ21-32、Aβ31-42四種表位肽段,分別構建可表達四種肽段與細菌鞭毛蛋白融合表達的重組質粒,并利用細菌鞭毛表面展示系統將其分別表達于E.coli GI826鞭毛上。SDS-PAGE電泳、Western blot及免疫熒光鑒定結果證明了四種Aβ抗原表位肽段與鞭毛蛋白融合表達并成功的展示于E.coli GI826表面。 其次,我們對Aβ1-42及其N端(Aβ1-12、Aβ1-15)進行了人源性抗體的高通量篩選。目前AD被動免疫研究所應用的抗體多為鼠源性抗體,限制了其在人體中的應用。而從人源性抗體庫中獲得的抗體則避免了這一問題,可不經人源化改造直接應用于人體。本研究中我們分別采用了針對Aβ1-12的細菌扣除篩選、針對Aβ1-42的固相篩選、針對Aβ1-12的細菌固相結合篩選、以及針對Aβ1-15的固相篩選四個篩選方案對庫容量可達1.35×1010的大容量全合成人源性噬菌體單鏈抗體庫進行了特異性抗體的篩選,實現了抗體的高通量篩選。在篩選過程中共隨機挑選、鑒定了約2000個克隆,其中細菌篩選克隆陽性率較低,固相篩選克隆陽性率可達50%,但是由于固相篩選是針對Aβ1-42全長進行篩選,獲得的特異性抗體可能與Aβ1-42的任意區(qū)域結合。為了針對AβN端進行高質量的抗體篩選,我們采用了先針對Aβ1-12進行細菌扣除篩選再應用Aβ1-42進行固相篩選的方案,針對Aβ1-12進行了細菌固相結合篩選,克隆陽性率可達40%。與此同時我們也針對Aβ1-15進行了固相篩選,但克隆陽性率較低。最終我們在細菌篩選過程中,獲得了一株特異性噬菌體抗體G10。在Aβ1-42固相篩選過程中,獲得了兩株特異性噬菌體抗體18、26。在細菌固相結合篩選過程中我們獲得了兩株特異性噬菌體抗體H9、B5。在Aβ1-15固相篩選過程中獲得了一株特異性抗體87。其中18與H9為同一株抗體,這一結果證明了我們所采用的方案可靠且有效。 再次,我們將獲得的特異性單鏈抗體改造為全抗體形式并對獲得瞬時表達的全抗體進行了特異性鑒定。為了獲得穩(wěn)定性更好的抗體形式,我們對篩選得到的5株特異性噬菌體單鏈抗體進行了全抗體形式的改造,并對這5株全抗體在293-F細胞中進行了瞬時表達。結果18及87號抗體未能得到表達,G10、26、B5獲得了表達。特異性鑒定結果發(fā)現G10失去了與Aβ1-42的結合能力,26、B5能與Aβ1-42特異性結合,最終我們獲得了26和B5兩株特異性的全抗體。 最后,我們對26和B5這兩株全抗體進行了表位鑒定,并對能與AβN端(Aβ1-12、Aβ1-15)結合的抗體進行了親和力檢測。利用細菌鞭毛表面展示的Aβ分段肽段對26和B5進行了表位鑒定,結果顯示26與Aβ31-42特異性結合,B5與Aβ1-12特異性結合,因此初步認為26的抗原表位位于Aβ31-42,B5的抗原表位位于Aβ1-12。非競爭ELISA結果顯示B5親和力為KD=1.4×10-8mol/L 綜上所述,我們建成了Aβ1-42分段表位肽段的細菌鞭毛展示系統,為今后對Aβ的表位研究工作打下了基礎,并且成功通過抗體庫的高通量篩選從大容量人源性噬菌體抗體庫中,獲得了兩株特異性單鏈抗體26和B5,在全抗體水平上進行表位鑒定,可初步認為26的表位位于Aβ31-42內,B5的表位位于Aβ1-12內,同時測得B5全抗體親和力為KD=1.4×10-8mol/L,為進一步深入研究AD的治療性抗體奠定基礎。
[Abstract]:Alzheimer's disease (AD) is a degenerative disease of the central nervous system that occurs frequently in the elderly. Its main clinical features are memory loss, cognitive and motor dysfunction. At present, the pathogenesis of AD is not very clear. Among them, amyloid protein (Abeta) is polymerized in the form of soluble monomer under normal physiological conditions. The accumulation of amyloid proteins with neurocytotoxicity is considered to be a key event in the pathogenesis of AD. Studies have shown that Abeta is a common pathway of various factors causing Alzheimer's disease and a key factor in the pathogenesis and development of AD. Therefore, Abeta is generally regarded as an effective target molecule for the treatment of AD. The beta-amyloid precursor protein (APP) is formed by the beta-metabolic pathway. It is generally composed of 39-43 amino acids and has a secondary structure of a beta-folded lamella. The molecule as a whole is hydrophobic, easy to aggregate and form insoluble deposits. In 1999, Schenk et al. first used Abeta 1-42 to host AD model mice. A breakthrough has been made in animal immunity. Since then, reports have confirmed that A-beta peptide and its antibody can be used in immunotherapy of AD and can achieve good therapeutic effect. Betabloc (AN1792), a vaccine of A-beta 1-42 developed by Elan Company, has been found to be effective in eliciting immune response and producing amyloid A-beta after phase I clinical trials. Sedimentation-bound antibodies can effectively activate microglia to clear plaques formed by amyloid A beta deposition and significantly improve cognitive function in patients. Unfortunately, during phase II clinical trials, some patients experienced inflammation in the brain and the tests were terminated. Meanwhile, passive immunotherapy for AD has been achieved. Great progress has been made. Studies have shown that anti-A-beta-N-terminal antibodies can effectively improve AD-related symptoms without triggering an immune response in Th1 cells. We hope that a large number of human phage antibody libraries will be screened by bacterial screening combined with solid phase screening to obtain specific antibodies, and lay a foundation for the development of therapeutic antibodies against AD.
Firstly, in order to screen antibodies against Abeta 1-12 and provide epitope peptides for preliminary epitope identification of specific antibodies, we divided Abeta 1-42 into four epitope peptides: Abeta 1-12, Abeta 12-23, Abeta 21-32 and Abeta 31-42 according to the molecular structure of Abeta 1-42 and the characteristics of bacterial flagella display system. The recombinant plasmids expressing four peptides fused with bacterial flagellin were expressed on E.coli GI826 flagella by bacterial flagella surface display system. SDS-PAGE electrophoresis, Western blot and immunofluorescence assay showed that the four peptides fused with flagellin and were successfully displayed on E.coli GI. The 826 surface.
Secondly, high throughput screening of human antibodies against A-beta-42 and its N-terminal (A-beta-12, A-beta-15) has been carried out. At present, most of the antibodies used in AD passive immunity research institute are mouse-derived antibodies, which limit their application in human body. The antibodies obtained from human antibody library avoid this problem and can be directly applied without humanization modification. In this study, we used deduction screening for A-beta-12, solid-phase screening for A-beta-42, solid-phase binding screening for A-beta-12, and solid-phase screening for A-beta-15 to screen a large-capacity phage single-chain antibody library with a capacity of 1.35 *1010. During the screening process, about 2000 clones were selected randomly, of which the positive rate of bacterial screening clones was low, and the positive rate of solid-phase screening clones could reach 50%. However, because solid-phase screening was aimed at the full-length screening of A-beta 1-42, the specific antibodies could be obtained with any region of A-beta 1-42. Domain binding. In order to screen high-quality antibodies against Abeta 1-12, we used the method of deduction screening for Abeta 1-12 and then solid-phase screening for Abeta 1-12. The positive rate of bacterial solid-phase binding screening for Abeta 1-12 was up to 40%. At the same time, we also carried out solid-phase screening for Abeta 1-15, but clone positive. Finally, we obtained a specific phage antibody G10 in the process of bacterial screening. Two specific phage antibodies 18,26 were obtained during the solid phase screening of A-beta 1-42. Two specific phage antibodies H9 and B5 were obtained during the solid phase screening of A-beta 1-15. A specific antibody 87.18 of which is the same as H9. This result proves that our scheme is reliable and effective.
Thirdly, we transformed the specific single-chain antibody into full-antibody form and identified the specificity of the instantaneous expression of the whole antibody. In order to obtain a more stable form of antibody, we modified the full-antibody form of the five strains of phage-specific single-chain antibodies and the five strains of antibodies were fine in 293-F. Results No. 18 and No. 87 antibodies were not expressed, and G10, 26 and B5 were expressed. Specificity identification showed that G10 lost its binding ability to AB1-42, 26 and B5 could specifically bind to AB1-42. Finally, we obtained two specific antibodies, 26 and B5.
Finally, we identified the epitopes of 26 and B5, and detected the affinity of the antibodies binding to the N terminal of A beta (A beta 1-12, A beta 1-15). The epitopes of 26 and B5 were identified by the A beta fragment peptides displayed on the flagella surface of bacteria. The results showed that 26 specifically binds to A beta 31-42 and B5 specifically binds to A beta 1-12. The antigenic epitope of 26 was located at A beta 31-42 and the antigenic epitope of B5 was located at A beta 1-12. Non-competitive ELISA showed that the affinity of B5 was KD=1.4 *10-8mol/L.
To sum up, we have constructed a flagella display system for the peptide fragments of Abeta 1-42, which lays a foundation for further study on the epitope of Abeta. Two specific single chain antibodies 26 and B5 were obtained from a large-scale phage antibody library by high-throughput screening of antibody library, and epitopes were carried out at the whole antibody level. The results showed that the epitope of 26 was located in A beta 31-42 and the epitope of B5 was located in A beta 1-12. The affinity of B5 antibody was 1.4 *10-8 mol/L, which laid a foundation for further study of therapeutic antibody of AD.
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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