發(fā)布時間：2018-08-28 16:04

【摘要】： 傳統(tǒng)觀點認為寄生蟲與宿主間的相互關(guān)系表現(xiàn)為寄生蟲對宿主的損害和宿主對寄生蟲的抵抗，而宿主對寄生蟲的抵抗主要表現(xiàn)為宿主的免疫應(yīng)答可以殺滅宿主體內(nèi)的部分寄生蟲并限制寄生蟲的再感染，與此同時，寄生蟲則利用各種方式逃避宿主的免疫攻擊。 然而，新近研究及流行病學(xué)資料顯示，在宿主免疫功能低下時，血吸蟲的發(fā)育或生殖力受限，提示宿主的免疫反應(yīng)對血吸蟲的影響可能不光局限于限制或殺滅，血吸蟲對宿主的免疫攻擊可能也不僅限于逃避，我們的假設(shè)是：在寄生蟲與宿主長期共進化過程中，血吸蟲為了生存，不僅設(shè)法逃避宿主的免疫攻擊，而且還可能利用宿主免疫反應(yīng)提供的某些效應(yīng)分子(如細胞因子、抗體等)，促進自身的發(fā)育或生殖，即宿主的免疫應(yīng)答可能有助于血吸蟲的發(fā)育或生殖。但是，迄今為止，哪種類型的免疫應(yīng)答或免疫反應(yīng)中哪些因素及效應(yīng)分子有利于血吸蟲的生長和繁殖，還遠不清楚。 研制有效的抗血吸蟲疫苗是防治血吸蟲病的根本途徑，疫苗的研究工作已超過半個世紀，然而，迄今為止，該研究仍無實質(zhì)性進展。由于目前對血吸蟲感染免疫的認識是建立在傳統(tǒng)觀點之上的，而抗血吸蟲疫苗研究的理論基礎(chǔ)也是建立在免疫反應(yīng)能殺滅蟲體或限制其產(chǎn)卵能力之上的，完全沒有考慮誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否會對血吸蟲產(chǎn)生有利作用。因此，深入認識血吸蟲感染的免疫對血吸蟲生長、發(fā)育及生殖的影響對疫苗研究尤為重要，闡明影響血吸蟲發(fā)育和繁殖的免疫應(yīng)答類型或效應(yīng)分子，將為在血吸蟲疫苗研究中如何激活不利于血吸蟲發(fā)育的因素而避免激活有利于血吸蟲發(fā)的因素提供理論基礎(chǔ)。 本研究通過觀察日本血吸蟲在不同免疫缺陷動物體內(nèi)的發(fā)育、生殖及宿主肝臟蟲卵肉芽腫的病理特點，探討不同免疫因素對日本血吸蟲發(fā)育、生殖及宿主蟲卵肉芽腫形成的影響。 本論文包括如下三部分： 第一部分T細胞對日本血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對蟲卵肉芽腫形成的影響 第二部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子Stat4和Stat6對血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對蟲卵肉芽腫形成的影響 第三部分宿主細胞因子IL-12、IL-4對血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對蟲卵肉芽腫形成的影響 第一部分T細胞對日本血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對蟲卵肉芽腫形成的影響 裸鼠是由于染色體內(nèi)裸體位點的等位基因(Nu基因)發(fā)生純合而形成的突變小鼠。該小鼠由于先天性胸腺缺陷，導(dǎo)致其體內(nèi)不能產(chǎn)生胸腺依賴淋巴細胞(T細胞)及其誘導(dǎo)的各類免疫反應(yīng)。我們利用裸鼠此特性，研究宿主T細胞缺陷對日本血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對宿主肝臟蟲卵肉芽腫形成的影響。 材料與方法 正常BALB／c小鼠及相同遺傳背景的裸鼠每只均感染日本血吸蟲尾蚴25條。兩組小鼠各分3小組，分別于感染后第28天、35天及42天剖殺小鼠，經(jīng)門靜脈灌注法收集蟲體，計數(shù)總蟲荷，然后于解剖顯微鏡下分別計數(shù)雌、雄蟲荷，并觀察蟲體發(fā)育情況。所有蟲體經(jīng)10％福爾馬林固定后，鹽酸卡紅酒精染色，并置于載玻片上用中性樹膠封固。將封固蟲體的玻片置于光學(xué)顯微鏡下等倍數(shù)碼成像，并導(dǎo)入Image pro 5．0圖像分析程序，測量并計算蟲體的長度。鏡下觀察蟲體，計數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)。 門靜脈灌注收集蟲體后摘取小鼠肝臟，從肝右葉切取部分新鮮肝組織，置于10％福爾馬林液中固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下組織病理學(xué)觀察。選擇切片中含單個蟲卵的肉芽腫，利用Image pro 5．0圖像分析系統(tǒng)，以蟲卵內(nèi)毛蚴為中心，測量肉芽腫直徑。剩余肝組織經(jīng)5％KOH溶液消化后，顯微鏡下計數(shù)蟲卵，并計算肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)。 所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示，用SPSS12．0進行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組間比較采用Student's雙尾t檢驗。 結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，兩組小鼠體內(nèi)總蟲荷及雌雄蟲配對數(shù)在感染后第28、35及42天均無差異，但感染后第28天，裸鼠體內(nèi)雌蟲及雄蟲長度均明顯低于正常BALB／c小鼠，且差異具極顯著性(p＜0．01)。然而，至感染后第35天，該差異縮小至無顯著性(p＞0．05)。至感染后第42天，兩組小鼠體內(nèi)蟲體長度已趨于一致。 裸鼠肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)在感染后各時間點均顯著低于正常BALB／c小鼠(p＜0．05)。裸鼠體內(nèi)雌蟲子宮蟲卵數(shù)在感染后第28、35及42天均略低于BALB／c小鼠，但差異均無顯著性(p＞0．05)。BALB／c小鼠在感染后第28天雌蟲子宮內(nèi)均有蟲卵產(chǎn)生，而裸鼠在感染后第28天有部分雌蟲(28．5％)子宮內(nèi)未見蟲卵，至感染后第35天仍有個別雌蟲(4．7％)子宮內(nèi)不含蟲卵，直至感染后第42天，所有被檢測雌蟲子宮內(nèi)才均含有蟲卵。 裸鼠肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑明顯小于BALB／c小鼠，且差異具極顯著性(p＜0．01)感染后第42天，正常BALB／c小鼠肝臟可見典型蟲卵肉芽腫形成，肉芽腫周圍未見明顯肝細胞壞死。裸鼠肝臟內(nèi)肉芽腫較不典型，且浸潤細胞顯著減少，其中，以嗜酸性粒細胞減少最為明顯。另外，裸鼠肝臟蟲卵肉芽腫周圍可見大面積肝細胞壞死。 結(jié)論 上述結(jié)果表明，宿主T細胞缺陷并不影響日本血吸蟲在宿主體內(nèi)的生存，且日本血吸蟲仍可在宿主體內(nèi)發(fā)育成熟并產(chǎn)卵。然而，T細胞缺陷時，蟲體發(fā)育及產(chǎn)卵明顯延遲，提示T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及某些相關(guān)特異性免疫因子的產(chǎn)生可能有利于血吸蟲在宿主體內(nèi)的移行或發(fā)育，但通過動態(tài)觀察，首次發(fā)現(xiàn)宿主T細胞缺陷對日本血吸蟲發(fā)育及產(chǎn)卵的影響是一過性的，主要作用于發(fā)育早期。 另外，蟲卵肉芽腫的形成有賴于T細胞，T細胞對介導(dǎo)肉芽腫內(nèi)嗜酸性粒細胞的浸潤具有重要作用。 第二部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子Stat4和Stat6對血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對蟲卵肉芽腫形成的影響 近年來，大量研究報道感染血吸蟲的宿主體內(nèi)輔助性CD4~+輔助性T細胞(Thcell)的分化方向，即向Th1細胞或Th2細胞亞群的分化，對宿主的保護性免疫效應(yīng)及蟲卵肉芽腫的免疫病理反應(yīng)具有重要影響。 Stat4和stat6分別為啟動Th細胞向Th1細胞和Th2細胞亞群分化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。當(dāng)Stat4缺乏時，刺激Th細胞向Th1細胞分化的信號途徑被阻斷，導(dǎo)致Th1型免疫反應(yīng)缺陷，而stat6缺乏則導(dǎo)致Th2型免疫反應(yīng)缺陷。 本研究利用Stat4基因敲除(Stat4~(-/-))小鼠和Star6基因敲除(Stat6~(-/-))小鼠，分別觀察宿主Th1型免疫缺陷和Th2型免疫缺陷對日本血吸蟲發(fā)育生殖及宿主蟲卵肉芽腫形成的影響。 材料與方法 正常BALB／c J小鼠及相同遺傳背景的Stat4~(-/-)、Stat6~(-/-)小鼠每只均感染日本血吸蟲尾蚴25條。三組小鼠各分3小組，分別于感染后第28天、35天及42天剖殺小鼠，經(jīng)門靜脈灌注法收集蟲體，計數(shù)總蟲荷及雌、雄蟲荷，并觀察蟲體發(fā)育情況。所有蟲體卡紅染色后，測量蟲體的長度，計數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)。門靜脈灌注收集蟲體后摘取小鼠肝臟，從肝右葉切取部分新鮮肝組織，置于10％福爾馬林液中固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下病理組織學(xué)觀察，測量切片中含單個蟲卵的肉芽腫直徑。剩余肝組織經(jīng)5％KOH溶液消化后，顯微鏡下計數(shù)蟲卵，并計算肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)(檢測方法同第一部分)。 所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示，用SPSS12．0進行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。 結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠體內(nèi)總蟲荷及雌雄蟲配對數(shù)在感染后第28、35及42天與BALB／c J小鼠相比均無差異。三組小鼠體內(nèi)蟲體長度在感染后各時間點亦均無差異(p＞0．05)。 Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠日本血吸蟲感染后第28天，肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)與BALB／c J小鼠無差異，至感染后第35天，Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠肝組織中產(chǎn)卵數(shù)略高于BALB／c J小鼠，至感染后第42天，該差異進一步增大但始終無顯著性(p＞0．05)。各組雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)在感染后第28天無明顯差異，至感染后第42天，Star4~(-/-)和Star6~(-/-)小鼠雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)略高于BALB／c J小鼠，但差異無顯著性(p＞0．05)。該結(jié)果與各組小鼠肝組織內(nèi)每對蟲體產(chǎn)卵量的變化趨勢一致。 此外，Stat4~(-/-)小鼠肝臟蟲卵肉芽腫纖維化較對照組組更為明顯，而Stat6~(-/-)小鼠肝臟蟲卵肉芽腫較不典型，纖維化不明顯。肉芽腫直徑在各組間無明顯差異(p＞0．05)。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠體內(nèi)蟲荷、蟲體長度、肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)及雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)與正常小鼠均無明顯差異，表明單純Th1型或Th2型免疫應(yīng)答對日本血吸蟲的生存、發(fā)育及生殖均無明顯影響。Stat4缺陷促進蟲卵肉芽腫纖維化，提示Th1型免疫應(yīng)答對蟲卵肉芽腫的纖維化有抑制作用。Stat6缺陷不利于蟲卵肉芽腫的形成及纖維化，提示Th2型免疫應(yīng)答對肉芽腫的形成及纖維化起關(guān)鍵作用。 第三部分宿主細胞因子IL-12、IL-4對血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及對蟲卵肉芽腫形成的影響 研究報道，細胞因子的刺激對Th細胞的分化具有重要作用。初始CD4~+Th細胞的分化受IL-12和IL-4的雙向調(diào)節(jié)。IL-12可促使初始Th細胞向Th1細胞分化，而IL-4可促使Th細胞向Th2細胞分化。血吸蟲感染中有關(guān)細胞因子的調(diào)控作用是目前的研究熱點。 關(guān)于細胞因子功能的研究傳統(tǒng)方法是通過靜脈注射抗細胞因子單克隆抗體來實現(xiàn)其中和作用。然而，觀察血吸蟲在終宿主體內(nèi)發(fā)育及蟲卵肉芽腫的形成需經(jīng)歷一個較長的過程，而抗體在宿主體內(nèi)會逐步降解而不能持續(xù)發(fā)揮中和作用，將能分泌相應(yīng)單克隆抗體的雜交瘤細胞直接接種于實驗動物體內(nèi)，則可保證單克隆抗體的持續(xù)分泌并有效的分布于血液及組織中。 本實驗將抗IL-12和抗IL-4的雜交瘤細胞分別接種于小鼠背部皮下，通過雜交瘤細胞持續(xù)分泌的相應(yīng)單克隆抗體中和小鼠體內(nèi)的IL-12或IL-4，觀察這些細胞因子缺陷對血吸蟲生長、發(fā)育、生殖和對蟲卵肉芽腫形成的影響。 材料與方法 將分泌抗小鼠IL-12的雜交瘤細胞(C 17．8)和分泌抗小鼠IL-4的雜交瘤細胞(11B11)經(jīng)PBS混懸后定量注射于BALB／c小鼠背部皮下，共接種兩次，兩次之間間隔三周。小鼠分為如下3組： 1)抗IL-12組(小鼠接種抗IL-12雜交瘤細胞) 2)抗IL-4組(小鼠接種抗IL-4雜交瘤細胞) 3)對照組(小鼠注射等體積PBS) 每只小鼠于首次接種雜交瘤細胞后4～5天感染日本血吸蟲尾蚴25條。于感染后第0、28及42天用雙抗夾心ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-12和IL-4水平。于感染后第28天和第42天，剖殺小鼠收集蟲體，計數(shù)總蟲荷及雌雄蟲配對數(shù)，對比各組小鼠體內(nèi)蟲體發(fā)育生殖狀況及肝臟蟲卵肉芽腫病理改變。所有蟲體經(jīng)鹽酸卡紅酒精染色，數(shù)碼成像，并導(dǎo)入Image pro 5．0圖像分析程序，測量并計算蟲體的長度，以了解蟲體發(fā)育情況；顯微鏡下計數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)；門靜脈灌注收集蟲體后摘取小鼠肝臟，經(jīng)消化后，計算肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)；感染后第42天，觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化。 所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示，用SPSS12．0進行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。 結(jié)果 接種抗IL-12或抗IL-4雜交瘤細胞的小鼠血清中均未檢測到相應(yīng)細胞因子。三組間蟲荷在感染后第28天及42天均無顯著性差異。然而，在感染后第28天，除了抗IL-12組外，抗IL-4組和對照組均可見少量幼蟲�？笽L-12組體內(nèi)蟲體長度在感染后28天及42天均大于抗IL-4組和對照組，且差異具有顯著性(p＜0．05)。而抗IL-4組和對照組之間蟲體長度無明顯差異。 抗IL-12組小鼠肝組織中每對蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)在感染后第28天顯著高于抗IL-4組及對照組(p＜0．05)，然而至感染后第42天，該差異縮小且無顯著性。 抗IL-12組雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)在感染后第28天明顯高于對照組(p＜0．05)。抗IL-12組在感染后第28天所有雌蟲子宮內(nèi)均已含有蟲卵，而抗IL-4組和對照組在該時間點均有少量雌蟲(抗IL-4組：6．3％；對照組：14．3％)子宮內(nèi)未見蟲卵。 在感染后第42天，抗IL-12組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫直徑明顯大于對照組(p＜0．05)，而抗IL-4組蟲卵肉芽腫較不典型，且直徑略小于對照組，但差異無顯著性(p＞0．05)。與對照組相比，抗IL-12組肉芽腫纖維化明顯增強，而抗IL-4組較不明顯。 結(jié)論 利用雜交瘤細胞皮下接種的方法能持續(xù)有效的中和小鼠血清中相應(yīng)細胞因子。IL-12或IL-4缺陷小鼠體內(nèi)蟲荷與正常小鼠無顯著性差異，提示細胞因子IL-12或IL-4對宿主體內(nèi)血吸蟲的存活無明顯影響。然而，IL-12缺陷有利于血吸蟲發(fā)育，提示IL-12對血吸蟲發(fā)育可能有阻礙作用。IL-4對日本血吸蟲的發(fā)育無明顯作用。抗IL-12組產(chǎn)卵提前且感染早期產(chǎn)卵量較正常組高，然而隨著感染時間的延長，其產(chǎn)卵量與正常小鼠無明顯差異，提示IL-12對雌蟲生殖的抑制作用可能是通過抑制其發(fā)育而實現(xiàn)的，此抑制作用是一過性的�？笽L-4處理可減弱蟲卵誘導(dǎo)的肝組織纖維化，而抗IL-12處理則明顯增強肝臟的纖維化，提示IL-4可促進肝臟蟲卵肉芽腫的纖維化，而IL-12則對纖維化有抑制作用。 全文小結(jié) 綜上3部分所述，本研究結(jié)論如下： 1．宿主T細胞缺陷時，，同本血吸蟲發(fā)育及產(chǎn)卵明顯延遲，提示T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及某些相關(guān)特異性免疫因子的產(chǎn)生可能有利于血吸蟲在宿主體內(nèi)的移行或發(fā)育，且T細胞對蟲卵肉芽腫的形成及肉芽腫內(nèi)嗜酸性粒細胞的浸潤具有重要作用。 通過動態(tài)觀察，首次發(fā)現(xiàn)宿主T細胞缺陷對日本血吸蟲發(fā)育及產(chǎn)卵的影響是一過性的，主要作用于發(fā)育早期。 2．利用Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠作為動物模型，首次證明單純Th1型或Th2免疫應(yīng)答對日本血吸蟲生長、發(fā)育或生殖均無明顯影響。Stat4缺陷促進蟲卵肉芽腫纖維化的形成，提示Th1型免疫應(yīng)答對蟲卵肉芽腫的纖維化有抑制作用；Stat6缺陷不利于蟲卵肉芽腫的形成，提示Th2型免疫應(yīng)答對肉芽腫的形成及局限化起關(guān)鍵作用。 3．通過將雜交瘤細胞直接接種于小鼠皮下，以借助其持續(xù)分泌的單克隆抗體中和相關(guān)細胞因子，觀察IL-12或IL-4缺陷對日本血吸蟲發(fā)育、生殖及蟲卵肉芽腫形成的影響。首次證實IL-12對血吸蟲的發(fā)育、生殖及對肉芽腫的纖維化有抑制作用，其中對血吸蟲的發(fā)育及生殖具的抑制作用是一過性的，而IL-4對日本血吸蟲的發(fā)育無明顯影響，但可促進肝臟蟲卵肉芽腫的纖維化。 綜合上述結(jié)果，我們認為宿主免疫應(yīng)答類型及某些細胞因子與蟲卵肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而能影響血吸蟲在宿主體內(nèi)生長、發(fā)育或生殖的是某些細胞因子；鑒于單純Th1型或Th2免疫應(yīng)答對日本血吸蟲生長、發(fā)育或生殖均無明顯影響，因此我們推測細胞因子對血吸蟲生長、發(fā)育或生殖的影響可能不是通過單純T細胞應(yīng)答類型而發(fā)揮作用的，細胞因子對血吸蟲生長、發(fā)育或生殖影響的具體作用機制還有待進一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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1 程喻力;宿主免疫應(yīng)答對日本血吸蟲生長、發(fā)育、生殖及蟲卵肉芽腫形成的影響[D];華中科技大學(xué);2009年

本文編號：2209902