【摘要】： 目的:Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類(lèi)病原分子識(shí)別受體,其生物學(xué)功能主要是識(shí)別微生物感染,促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和先天性免疫;TLRs活化后還可以促進(jìn)免疫細(xì)胞表達(dá)免疫分子,促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟,從而誘導(dǎo)機(jī)體的獲得性免疫反應(yīng),因而TLRs又是機(jī)體介導(dǎo)天然免疫轉(zhuǎn)向獲得性免疫的橋梁。TLR3是機(jī)體識(shí)別病毒雙鏈RNA(dsRNA)的受體,在體內(nèi)抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。一方面dsRNA作用于TLR3誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化,促使免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子如IFNα、β等,發(fā)揮抗病毒天然免疫作用;另一方面活化的TLR3可介導(dǎo)組織細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞)的損傷,從而破壞宿主的血管屏障如血腦屏障,促進(jìn)病毒的擴(kuò)散。本研究的目的是在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析活化TLR3誘導(dǎo)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡的分子機(jī)制,尋找TLR3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控分子,并嘗試以此為靶點(diǎn)對(duì)TLR3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行干預(yù),為臨床選擇新的靶點(diǎn)控制病毒性疾病的發(fā)展提供理論依據(jù)。 方法:(1)RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá);(2)ELISA檢測(cè)分泌蛋白的水平;(3)PI-Annexin V染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平;(4)抗體中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞因子與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性;(5)Western-Blotting檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)和活化情況;(6)SiRNA干擾技術(shù)下調(diào)目的基因的表達(dá)。 結(jié)果:ELISA結(jié)果表明dsRNA的類(lèi)似物Poly(I:C)作用于HUVEC細(xì)胞,上調(diào)TNF-α的分泌,且呈劑量依賴性;重組的TNF-α誘導(dǎo)了HUVEC細(xì)胞中NF-κB的活化,但不能誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的凋亡,而且TNF-α的中和抗體不能下調(diào)Poly(I:C)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,說(shuō)明Poly(I:C)活化TLR3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與TNF-α無(wú)關(guān)。Poly(I:C)作用于HUVEC細(xì)胞后,RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRAIL、DR4和DR5的表達(dá)上調(diào),且呈劑量依賴性;PI-Annexin V染色證明TRAIL中和抗體部分下調(diào)了Poly(I:C)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表明TRAIL-DR4/5啟動(dòng)外源性凋亡途徑參與了TLR3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究表明Poly(I:C)下調(diào)Bcl-2家族中促生存蛋白Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Bcl-2家族中促凋亡蛋白Noxa和Puma的表達(dá),同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控分子P21的表達(dá),由于這些分子同時(shí)受腫瘤抑制基因P53或其家族成員的調(diào)控,提示P53或其家族成員參與了TLR3誘導(dǎo)的通過(guò)內(nèi)源性途徑介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。然而RT-PCR結(jié)果顯示活化TLR3并不引起P53的表達(dá)改變,P53的抑制劑也不影響Poly(I:C)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表明P53沒(méi)有參與Poly(I:C)誘導(dǎo)的損傷;當(dāng)檢測(cè)P53家族成員P63的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),Poly(I:C)上調(diào)TAP63α的表達(dá);而且SiRNA抑制TAP63α蛋白的表達(dá)后,抑制了Bcl-2的下調(diào),抑制了Noxa的上調(diào),抑制了Caspase8、Caspase 9和PARP的活化,并顯著抑制Poly(I:C)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表明TAP63α是調(diào)控TLR3誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵分子。 結(jié)論:TNF-α不參與TLR3誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡的外源性途徑的啟動(dòng);TRAIL-DR4/DR5作用機(jī)制參與了TLR3誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡的細(xì)胞外途徑的啟動(dòng);TLR3通過(guò)下調(diào)Bcl-2家族中的促生存分子Bcl-2表達(dá),上調(diào)促凋亡分子Noxa表達(dá)上調(diào)啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。P53家族成員TAp63α是TLR3誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子。
[Abstract]:AIM: Toll-like receptors (TLRs) are a class of pathogenic molecular recognition receptors. Their biological functions are mainly to recognize microbial infections, promote the synthesis and release of inflammatory cytokines, mediate inflammation and innate immunity. Activation of TLRs can also promote the expression of immune molecules in immune cells and promote the formation of antigen presenting cells. TLRs are the bridge between the innate immunity and the acquired immunity. TLR3 is the receptor that recognizes the double-stranded RNA (dsRNA) of the virus and plays an important role in anti-virus infection. On the one hand, dsRNA acts on TLR3 to induce the activation of immune cells and induce immune cells to produce anti-virus. Viral cytokines such as IFN alpha and beta play a natural immune role against viruses. On the other hand, activated TLR3 can mediate the damage of tissue cells (such as vascular endothelial cells), thereby destroying the host vascular barrier such as blood-brain barrier, and promoting the spread of viruses. The purpose of this study is to further analyze the role of activated TLR3 in inducing human beings on the basis of previous studies. The molecular mechanism of apoptosis in vein endothelial cells (HUVEC) is to find the key regulators in the signal transduction pathway of TLR3-induced apoptosis, and try to interfere with the apoptosis induced by TLR3 as a target, so as to provide theoretical basis for clinical selection of new targets to control the development of viral diseases.
Methods: (1) RT-PCR detection of gene expression; (2) ELISA detection of secretory protein; (3) PI-Annexin V staining flow cytometry detection of apoptosis; (4) antibody neutralization test to verify the correlation between cytokines and apoptosis; (5) Western-Blotting detection of cell signal transduction molecule expression and activation; (6) SiRNA interference technology under the SiRNA interference. The expression of target genes.
Results: ELISA showed that poly (I:C), a dsRNA analogue, increased the secretion of TNF-alpha in HUVEC cells in a dose-dependent manner; recombinant TNF-alpha induced the activation of NF-kappa B in HUVEC cells, but could not induce the apoptosis of HUVEC cells, and the neutralizing antibody against TNF-alpha could not down-regulate the apoptosis induced by poly (I:C), indicating that poly (I:C) activated TLR. The expression of TRAIL, DR4 and DR 5 was up-regulated in a dose-dependent manner after poly (I:C) acted on HUVEC cells. PI-Annexin V staining showed that TRAIL neutralizing antibody partially down-regulated the apoptosis induced by poly (I:C), suggesting that TRAIL-DR4/5 initiated exogenous apoptosis pathway participated in TLR3-induced fine cells. Further studies have shown that Poly(I:C) down-regulates the expression of Bcl-2, up-regulates the expression of Noxa and Puma, and up-regulates the expression of P21, which are both regulated by tumor suppressor gene P53 or its family members, suggesting the formation of P53 or its family. However, the results of RT-PCR showed that activated TLR3 did not change the expression of P53, and the inhibitor of P53 did not affect the apoptosis induced by Poly (I:C), suggesting that P53 did not participate in the injury induced by Poly (I:C). Poly (I:C) up-regulated the expression of P63 in P53 family members. Moreover, SiRNA inhibited the down-regulation of Bcl-2, inhibited the up-regulation of Noxa, inhibited the activation of Caspase 8, Caspase 9 and PARP, and significantly inhibited the apoptosis induced by Poly (I:C), suggesting that TAP63a was a key molecule in regulating TLR3-induced cell injury.
Conclusion: TNF-alpha does not participate in the initiation of exogenous pathway of TLR3-induced apoptosis of HUVEC cells; the mechanism of TRAIL-DR4/DR5 participates in the initiation of extracellular pathway of TLR3-induced apoptosis of HUVEC cells; TLR3 up-regulates the expression of Noxa, a pro-apoptotic molecule, by down-regulating the expression of Bcl-2 in the Bcl-2 family. 3 family member TAp63 alpha is a key regulator of TLR3 induced apoptosis in HUVEC cells.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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