發(fā)布時(shí)間：2018-07-16 19:00

【摘要】： 目的:構(gòu)建重組乙酰膽堿受體α亞單位-BirA識(shí)別多肽序列基因(pcDNA3.1-AChRα-BirA)并對其進(jìn)行真核基因表達(dá)。方法:設(shè)計(jì)引物生物素蛋白連接酶(BirA)識(shí)別多肽序列基因。將載體pcDNA3.1-AChRα經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRv單酶切后,用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收并純化,與BirA識(shí)別多肽序列基因連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α并擴(kuò)增,再用EcoRv單酶切檢查BirA識(shí)別多肽序列基因插入的正確性,并測序驗(yàn)證,然后將構(gòu)建成功的載體在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以綠色熒光標(biāo)記,經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡驗(yàn)證。結(jié)果:電泳檢查發(fā)現(xiàn)了大小為63 bp的條帶,并測序驗(yàn)證了插入的基因序列為BirA識(shí)別多肽序列基因。轉(zhuǎn)染后,經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡可觀察到CHO細(xì)胞膜上的綠色熒光。結(jié)論:成功構(gòu)建了AChRα-BirA識(shí)別多肽序列基因重組載體,并在CHO細(xì)胞中很好表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為下一步構(gòu)建AChRα四聚體并作為抗原檢測乙酰膽堿受體抗體奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aim: to construct recombinant acetylcholine receptor 偽 subunit -BirA recognition polypeptide gene (pcDNA3.1-AChR 偽 -BirA) and express it in eukaryotic. Methods: primer biotin protein ligase (BirA) was designed to recognize polypeptide gene. The vector pcDNA3.1-AChR 偽 was digested by restriction endonuclease EcoRv and purified by low melting point agarose gel electrophoresis. The ligation product was transformed into E. coli DH5 偽 and amplified. The correctness of the insertion of BirA recognized polypeptide gene was examined by EcoRv digestion, and then the constructed vector was expressed in Chinese hamster ovarian cells (Cho). The expressed product was labeled with green fluorescence and verified by laser scanning confocal microscope. Results: a 63 BP fragment was identified by electrophoresis, and the inserted gene was confirmed by sequencing as a BirA recognized polypeptide gene. Green fluorescence on Cho cell membrane was observed by laser scanning confocal microscope after transfection. Conclusion: AChR 偽 -BirA recognition polypeptide gene recombinant vector was successfully constructed and expressed well in Cho cells. This study laid a foundation for the further construction of AChR 偽 tetramer and the detection of acetylcholine receptor antibodies as antigens.
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2127361