【摘要】： 目的 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是肺炎、腦膜炎和中耳炎的主要病因,也是引起全世界范圍內嬰幼兒、老年人和免疫缺陷個體疾病的主要病原菌。隨著耐藥菌株的不斷發(fā)現,疫苗在其感染防治中的作用越來越重要。目前,所用的主要是23價肺炎多糖疫苗和7價結合疫苗,前者覆蓋的血清型有限而且不是T細胞依賴性的,對免疫系統發(fā)育不完善的2歲以下小孩和老年人的保護性弱;后者存在莢膜血清型轉換和載體攜帶的莢膜多糖血清型數量有限以及在肺炎高發(fā)人群中的保護作用小等問題,并且生產成本很高,不適合在發(fā)展中國家大量使用。 S.pn根據莢膜分為90多個血清型,開發(fā)對所有血清型S.pn都起抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前S.pn疫苗的發(fā)展方向。近年來發(fā)現的S.pn蛋白質侯選疫苗ClpP(caseinolytic protease P, ClpP)是ATP依賴的絲氨酸蛋白水解酶,其在S.pn的生存、致病和入血過程中起著重要的作用,針對其靶點的疫苗或抗生素越來越顯示出其潛在的價值。本研究旨在探討ClpP在不同S.pn菌株中的基因序列保守性、在不同血清型S.pn中表達情況,并進一步驗證含有ClpP活性成分的疫苗能否抵抗不同型別的肺炎鏈球菌的侵襲性感染,以明確ClpP蛋白疫苗的保護范圍,為自主開發(fā)S.pn蛋白疫苗奠定基礎。 方法 1.檢測12株S.pn細菌中的ClpP基因以TIGR4型S.pn的ClpP基因序列設計引物,分別以12株不同血清型S.pn的基因組DNA為模板,對ClpP基因進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增、膠回收產物與PMD-18克隆載體連接后進行測序,利用DNAssist軟件,將12個重組克隆質粒雙向測序的結果及預測的氨基酸序列與Gene Bank數據庫對已公布的TIGR4肺炎鏈球菌全基因組序列進行相似性分析。 2.Western Blot檢測ClpP蛋白的表達將12株S.pn從C+Y培養(yǎng)基中收獲后,用PBS洗3次,用1×上樣buffer處理,再于100℃水浴5 min。全菌裂解物經SDS-PAGE電泳分離后轉膜。以anti-ClpP多克隆抗體為一抗(1:400),羊抗鼠HRP-IgG為二抗(1:5000),DAB為顯色底物,Western Blot檢測菌體中ClpP蛋白的表達。與此同時,以金黃色葡萄球菌作為對照。 3.主動免疫保護實驗將含有重組質粒pET32a(+)/ClpP工程菌BL21(DE3)經IPTG誘導后表達ClpP蛋白,經純化后與鋁佐劑混合后經腹腔注射免疫小鼠,而對照小鼠則用PBS與鋁佐劑混合后進行免疫。免疫程序:分別于0天、14天、28天將重組蛋白與鋁佐劑(Inject Alum購于Pierce)1:1混合后經腹腔注射免疫組小鼠;同時用PBS與鋁佐劑1:1混合后經腹腔注射對照組小鼠,每只200μl。初次免疫5周后用ELISA法測小鼠針對ClpP蛋白的抗體免疫應答水平,末次免疫2周后用12個型別S.pn攻擊,監(jiān)測其生存時間。 4.抗體被動免疫保護實驗在攻擊BALB/c小鼠之前,兔抗體被純化。12株肺炎鏈球菌在C+Y培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期,每一株細菌菌液各2ml分別與anti-ClpP特異抗體和非特異血清混合,于4℃過夜。次日兩種血清處理的10μl菌液置于玻片上用顯微鏡下觀察。剩下的菌液分別攻擊經過隨機分組的小鼠,各12只,每只小鼠經腹腔接受100μl的菌液,連續(xù)檢測小鼠的生存狀態(tài)至第7天,各組小鼠的半數生存時間用Mann-Whitney U進行統計學分析,各組小鼠的生存率用Fisher精確統計學方法進行分析。 結果 1.以12個血清型S.pn DNA為模板用編碼ClpP蛋白基因的特異性引物進行PCR擴增,結果12個PCR產物電泳后出現大小一致,單一的條帶。將這些PCR產物與PMD-18T進行亞克隆后,經雙向測序不同株的ClpP基因編碼區(qū)大小與TIGR4菌株中ClpP基因一樣,均為591 bp,基因序列一致性超過99%。由于遺傳密碼子的簡并性,預測的氨基酸序列一致性則為99.5%以上。 2.利用Western Blot方法檢測12株不同血清型S.pn的ClpP蛋白的表達。S.pn全菌裂解物經電泳分離后,與制備的anti-ClpP血清反應,12型S.pn全菌裂解物均在約21kD的位置出現特異性反應條帶,而陰性對照未見反應條帶出現。該結果提示了12個型別S.pn中均有ClpP蛋白抗原的表達。 3.Trx-ClpP融合蛋白經腹腔免疫BALB/c小鼠產生高滴度的抗體后,末次免疫2周后,12個型別S.pn經腹腔感染小鼠后。各組小鼠生存時間和生存率經統計學分析后,免疫組小鼠的中位生存時間與對照組小鼠中位生存時間有統計學意義(P0.05),免疫組小鼠的中位生存時間明顯延長,兩者生存率相比也具有顯著的統計學意義(P0.05)。該結果表明ClpP融合蛋白免疫小鼠后可產生針對多個血清型S.pn的保護性免疫。另外,我們以免疫后14天的間隔時間取小鼠血用ELISA法測定anti-ClpP的效價,抗體效價至少維持了98天。 4.12株S.pn能與anti-ClpP混合后能出現凝集,與非特異血清混合無凝集現象出現。用anti-ClpP特異抗體處理的S.pn攻擊小鼠,與非特異血清處理的同株S.pn攻擊小鼠的生存時間相比較,中位生存時間明顯延長,觀察期末小鼠的生存率也明顯提高,具有顯著的統計學意義。 結論 1.不同血清型肺炎鏈球菌的ClpP的DNA序列和蛋白序列高度保守。 2.不同血清型肺炎鏈球菌ClpP基因編碼的蛋白均有表達。 3.用含有ClpP活性成分的疫苗免疫小鼠后,小鼠產生了高滴度的抗體,并且小鼠能抵抗不同型別的S.pn的侵襲性感染,進一步驗證了ClpP蛋白疫苗的保護范圍不受血清型限制的。而且小鼠體內anti-ClpP抗體滴度水平維持時間長。 4.抗ClpP的多克隆血清能夠與完整的S.pn進行結合,并且能夠保護BALB/c小鼠抵抗12株S.pn的致死劑量的攻擊。
[Abstract]:Purpose



Streptococcus pneumoniae ( S . pn ) is the main cause of pneumonia , meningitis and otitis media .



S . pn - protein candidate vaccine ClpP ( ClpP ) is an ATP - dependent serine proteolytic enzyme which plays an important role in the survival , pathogenic and blood - feeding process of S.pn . The aim of this study is to investigate the gene sequence conservation of ClpP in different S.pn strains , and to further verify whether the vaccine containing the ClpP active ingredient can resist the invasive infection of different types of S . pneumoniae , so as to establish the protective scope of the ClpP protein vaccine and lay the foundation for the development of the S . pn protein vaccine .



method



1 . The ClpP gene of 12 strains of S.pn was detected by the ClpP gene sequence of type S . pn . The genomic DNA of 12 strains of S.pn was amplified by polymerase chain reaction ( PCR ) . The PCR was used to amplify the ClpP gene . The results of two - way sequencing and the predicted amino acid sequence of 12 recombinant clones were analyzed by using DNAssist software .



2 . The expression of ClpP protein was detected by Western Blot . After harvest , 12 strains of S.pn were harvested from C + Y medium , washed three times with PBS , treated with 1 脳 10 鈩，

本文編號：2127716