【摘要】： 目的研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離純化、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和成軟骨分化的現(xiàn)象與規(guī)律以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1對(duì)MSCs成軟骨分化的影響。探討在體外單層培養(yǎng)條件下,不同濃度轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1(TGF-β_1)對(duì)誘導(dǎo)人骨髓MSCs向軟骨細(xì)胞分化的作用有無(wú)差異,找出最有利于人骨髓MSCs向軟骨細(xì)胞分化的TGF-β_1濃度。為臨床使用自體間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)軟骨缺損提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考。 方法在無(wú)菌條件下,從3名健康成年男性志愿者髂后上棘抽取5ml骨髓標(biāo)本置于抗凝環(huán)境。用密度為1.077g/mL的Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲取有核細(xì)胞層,以5×10~6/cm~2密度接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,置于37℃含5%CO_2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后半量換液,棄去不貼壁的細(xì)胞。以后每2～3天換液一次,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)按1∶3行傳代培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)三代后MSCs基本純化。取第三代MSCs接種96孔板,于傳代后8天內(nèi)每天取10孔行MTT檢測(cè),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。用含有不同濃度轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)第三代MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化,每日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)三周后,各組細(xì)胞行甲苯胺蘭染色、阿利新藍(lán)染色,免疫熒光法檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá),阿利新藍(lán)比色法測(cè)定葡萄糖氨基聚糖(GAG)含量。最后統(tǒng)計(jì)分析各組間結(jié)果有無(wú)差異。 結(jié)果(1)原代人骨髓MSCs細(xì)胞呈梭形,形態(tài)幼小細(xì)短,排列松散。隨著細(xì)胞數(shù)量增加出現(xiàn)小細(xì)胞群落,細(xì)胞間排列逐漸緊密,出現(xiàn)典型長(zhǎng)梭形細(xì)胞,培養(yǎng)10天后細(xì)胞達(dá)到909/6融合。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快,約7天左右細(xì)胞可長(zhǎng)滿瓶底,細(xì)胞呈漩渦狀緊密排列。三代后細(xì)胞形態(tài)趨于一致,呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞兩端有長(zhǎng)絲狀偽足。(2)第三代MSCs有48小時(shí)左右的潛伏期,傳代3天后細(xì)胞開(kāi)始緩慢增殖,5天后擴(kuò)增速度明顯增加,5～7天細(xì)胞數(shù)量快速增加,排列逐漸規(guī)律,7天后細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期。(3)成軟骨誘導(dǎo)前5天細(xì)胞形態(tài)變化不大,第2周細(xì)胞逐漸變得寬大扁平,向多角形及多分支樣形態(tài)發(fā)展�？瞻讓�(duì)照組中觀察到部分細(xì)胞發(fā)生空泡狀變化,形態(tài)酷似脂肪細(xì)胞。誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞增殖速度較未誘導(dǎo)時(shí)明顯減慢,約9天左右細(xì)胞數(shù)量增加1倍。(4)誘導(dǎo)3周后,行甲苯胺藍(lán)染色,各組細(xì)胞染色結(jié)果有明顯差異�？瞻讓�(duì)照組染色呈陰性,10μg/L、20μg/L組呈陽(yáng)性,5μg/L組染色呈弱陽(yáng)性。(5)阿利新藍(lán)染色結(jié)果和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果一致。(6)Ⅱ型膠原免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示各組間有明顯差異�？瞻讓�(duì)照組無(wú)熒光,5μg/L組熒光微弱。10μg/L、20μg/L兩組細(xì)細(xì)胞質(zhì)中有紅色熒光,同時(shí)細(xì)胞外也有細(xì)顆粒狀淡染色熒光區(qū)域。(7)葡萄糖氨基聚糖(GAG)含量檢測(cè),各組間GAG含量有明顯差異。5μg/L、10μg/L、20μg/L組的GAG含量均高于空白對(duì)照組,5μg/L、10μg/L、20μg/L組間GAG含量也各不相同,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論(1)用Ficoll分離液密度梯度離心法獲得的人骨髓MSCs可以進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增,細(xì)胞增生活躍,可以連續(xù)傳代。(2)成軟骨誘導(dǎo)過(guò)程中人MSCs增殖減慢,形態(tài)逐漸發(fā)生改變,向扁平寬大、多角多分支形態(tài)變化。(3)人骨髓MSCs在平面培養(yǎng)條件下可以發(fā)生軟骨細(xì)胞分化,TGF-β_1是維持MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的必要條件。(4)研究表明:不同濃度的TGF-β_1對(duì)于促進(jìn)MSCs的成軟骨分化作用效果不同,10μg/L為促進(jìn)軟骨分化的最佳濃度。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of transforming growth factor 尾 _ 1 ( TGF - 尾 _ 1 ) on the differentiation of human bone marrow MSCs into chondrocytes in vitro .


Methods The cells were cultured in 25 ml cell culture flask with density of 1.077 g / mL Ficoll human lymphocyte separation solution density gradient centrifugation .


Results ( 1 ) The bone marrow MSCs of the primary generation were spindle - shaped , small in shape and loose in arrangement . ( 7 ) Glucosamine ( GAG ) content was detected , GAG content in each group was significantly different . GAG content of 5 渭g / L , 10 渭g / L , 20 渭g / L group was higher than that in blank control group , 5 渭g / L , 10 渭g / L and 20 渭g / L group .


Conclusion ( 1 ) Human bone marrow MSCs can be cultured and expanded in vitro by Ficoll separation liquid density gradient centrifugation .
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2119278