本文選題：AMP激活蛋白激酶 + α亞基　； 參考：《山東大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景：AMP激活蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,活化后通過磷酸化下游蛋白的某些絲氨酸或蘇氨酸殘基增強(qiáng)或抑制該蛋白的生物學(xué)活性從而調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝。各種導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP消耗增加合成減少從而導(dǎo)致AMP／ATP比值升高的因素均可引起AMPK活化。AMPK活化后能夠抑制各耗能過程如膽固醇合成、甘油三酯和蛋白質(zhì)合成,抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水解,減少骨骼肌細(xì)胞脂肪氧化,抑制細(xì)胞生長分化,從而維持細(xì)胞能量平衡,保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷。多種應(yīng)激條件如缺血、缺氧、饑餓均能激活A(yù)MPK。越來越多的證據(jù)表明,AMPK活化對于心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。AMPK活化不僅能夠調(diào)節(jié)膽固醇代謝、改善血脂異常,還能夠通過改善內(nèi)皮功能發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的有益作用。 AMPK以三聚體形式存在,包括一個(gè)催化亞基α及兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基β和γ,哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)三亞基共表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí),AMPK最大活性需要三個(gè)亞基同時(shí)存在。鑒于AMPK在維持機(jī)體和細(xì)胞能量代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能中的重要作用,AMPK被認(rèn)為是未來治療代謝性疾病和心血管疾病最有希望的靶蛋白之一,了解AMPK蛋白結(jié)構(gòu)和活性調(diào)節(jié)機(jī)制對尋找新的AMPK活性調(diào)節(jié)藥物具有重要意義。 目前,因?yàn)锳MPKα基和β亞基無法形成蛋白結(jié)晶,AMPK三聚體的完整晶體結(jié)構(gòu)尚不完全清楚。蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是各生物酶發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ),蛋白結(jié)構(gòu)改變會影響酶活性。既往關(guān)于AMPKα亞基結(jié)構(gòu)的研究均限于α亞基N末端催化結(jié)構(gòu)域,而對于C末端的認(rèn)識僅局限于C末端提供β亞基結(jié)合位點(diǎn),對于C末端在調(diào)節(jié)AMPK激酶活性中的作用仍缺乏了解。Towley等對α亞基C末端氨基酸序列進(jìn)行分析后提出,α亞基C末端在二級結(jié)構(gòu)上和MARK3 C末端高度相似,均為α螺旋和β片層相間的“三明治”結(jié)構(gòu),具有形成1型激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(kinase-associated domain 1, KA1)的基礎(chǔ)。研究AMPKα亞基C末端的蛋白結(jié)構(gòu)對于了解AMPK活性調(diào)節(jié)機(jī)制,尋找研發(fā)調(diào)節(jié)AMPK活性的新藥物具有重要意義。 目的：研究AMPK各亞基間相互作用及其活性調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法：(1)分離AMPKα2及α1基因敲除小鼠骨骼肌、心臟、腎臟及腦組織,通過蛋白印漬技術(shù)檢測AMPKα及β亞基蛋白表達(dá)水平并通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測其mRNA水平。(2)通過RNA干擾技術(shù)分別減少AMPKα1、α2、β1、β2表達(dá)后檢測AMPKα及β亞基蛋白表達(dá)水平。(3)放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)(Cycloheximide Pulse Chase)分別檢測野生型和AMPKα亞基敲除小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)AMPKβ亞基蛋白降解速率。(4)構(gòu)建了一系列表達(dá)逐漸缺失α亞基C末端的GST融合蛋白質(zhì)粒,分別表達(dá)全長α亞基WTα2、a2(1～540,a2△12)α2(1～476)、α2(1～426)和α2(1～412),利用GST beads提取并純化后,加入α亞基敲除成纖維細(xì)胞的蛋白裂解液,檢測不同長度α亞基與β亞基的結(jié)合情況,判斷α2亞基上β亞基的結(jié)合位點(diǎn)。(5)利用PDB蛋白域數(shù)據(jù)庫(Protein Domains Database)中已有的AMPK晶體蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,使用Root Mean Square Disturbance (RMSD)計(jì)算軟件,計(jì)算β亞基在α亞基存在或缺失時(shí)的RMSD改變,以此反映β亞基蛋白空間構(gòu)象在液相中的改變程度；使用GROMACS-4.0顯示研究β亞基在α亞基存在或缺失時(shí)原子空間軌跡變化；RMSD計(jì)算正常α亞基及其突變體在液相中的構(gòu)象變化,以及在其構(gòu)象變化中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。(6)利用AMPKα亞基敲除小鼠成纖維細(xì)胞(Murine Embryonic Fibroblasts, MEFs)作為AMPK酶活性檢測系統(tǒng),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后過表達(dá)AMPKα2正常全長蛋白(WTα2)和突變蛋白,通過檢測AMPK下游蛋白乙酰輔酶A脫羧酶(acetyl CoA Carboxylase, ACC)的磷酸化水平反應(yīng)AMPK激酶活性。 結(jié)果：(1)AMPKα、β亞基間的相互作用對維持彼此的蛋白穩(wěn)定性具有重要作用,α亞基缺失時(shí)β亞基蛋白水平降低,同樣,β亞基缺失時(shí)α亞基的蛋白水平亦降低。 (2)與α亞基存在時(shí)相比,α亞基缺失后,β1及β2亞基mRNA水平不變,蛋白穩(wěn)定性下降,蛋白降解加速。放線菌酮處理3小時(shí)后,α亞基敲除細(xì)胞中β1剩余約21%,而野生型細(xì)胞中,β1剩余約58%(p0.05)。 (3)小鼠AMPKα2亞基上第412～426位氨基酸在α、β相互作用中具有關(guān)鍵意義。第412～426位氨基酸缺失嚴(yán)重影響α2亞基與β亞基的結(jié)合。 (4)α2亞基第540～552位氨基酸缺失后(α2△12)不影響其與β亞基的結(jié)合,但AMPK激酶活性降低。α2△12能夠作為無功能突變體阻斷內(nèi)源性AMPK的作用。在HEK 293細(xì)胞中分別過表達(dá)和WTα2和α2△12,AMPK特異活化劑AICAR刺激后,磷酸化AMPK (pAMPK)及pACC水平均明顯增高,與空質(zhì)粒對照組相比,WTα2過表達(dá)時(shí),細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平pACC相應(yīng)增加,AICAR刺激后pACC進(jìn)一步增高；相反,過表達(dá)α2△12時(shí),雖然pAMPK明顯增加,pACC水平并未相應(yīng)增加,提示AMPK活性下降。(5)在已有的AMPK晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行計(jì)算機(jī)三維結(jié)構(gòu)模擬后認(rèn)為,AMPKα亞基C末端三維結(jié)構(gòu)與MARK3的C末端高度吻合,有可能形成類似KA1結(jié)構(gòu)域的能夠調(diào)節(jié)AMPK活性的結(jié)構(gòu)域,第540～552位氨基酸可能在α2亞基C末端特殊αβ疏水結(jié)構(gòu)域形成中具有重要作用。位于該結(jié)構(gòu)域疏水中心的第550位和546位亮氨酸突變?yōu)闃O性親水性谷氨酸后,AMPK激酶活性亦明顯降低。 結(jié)論：AMPKα、β亞基間相互作用對于維持亞基穩(wěn)定性具有重要意義。α2亞基C末端由α螺旋和β片層形成的具有疏水中心的特殊結(jié)構(gòu)域在維持AMPK激酶活性中具有重要意義。α2亞基C末端a螺旋(a.a 540～552)缺失或者第550位和546位亮氨酸發(fā)生突變后均可能因?yàn)槠茐脑摻Y(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)從而降低AMPK激酶活性。 研究意義：單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP),是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異,形成的遺傳標(biāo)記,其數(shù)量眾多,現(xiàn)在普遍認(rèn)為SNP研究是人類基因組走向應(yīng)用的重要步驟。SNP將為高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。近年來,關(guān)于AMPK基因多態(tài)性與代謝性疾病如脂代謝異常及2型糖尿病相關(guān)性的研究也在逐步開展。迄今已報(bào)導(dǎo)多個(gè)位于AMPK各亞基基因外顯子內(nèi)能夠改變AMPK氨基酸序列的SNP。其中,γ2點(diǎn)突變與WPW綜合征及家族性肥厚型心肌病密切相關(guān),攜帶γ3 R200Q突變的豬表現(xiàn)為糖原沉積性疾病。我們的研究提示,在人群中,特別是存在代謝異常的人群中是否存在L550Q、L546Q的突變從而影響AMPK激酶活性及其與代謝性疾病的相關(guān)性值得進(jìn)一步研究。 血流切應(yīng)力是血液流經(jīng)血管時(shí)作用于血管內(nèi)膜的摩擦力,生理狀態(tài)下血管直段的層流切應(yīng)力(Laminar Shear Stress)對于維持血管正常功能具有重要意義,參與調(diào)節(jié)血管緊張度、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)等。本實(shí)驗(yàn)主要通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了層流切應(yīng)力對內(nèi)皮細(xì)胞線粒體生物合成、氧化應(yīng)激狀態(tài)及血管張力的調(diào)節(jié)及其相關(guān)機(jī)制。方法：(1)將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC, ECs)暴露于12dyns／cm2層流切應(yīng)力下12小時(shí)后,應(yīng)用MitoTracker探針對ECs內(nèi)線粒體染色,共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體的數(shù)量和體積；MTT試劑盒檢測線粒體抗氧化活性(2)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測線粒體生物合成相關(guān)基因如PGC1a、COX4和NRF1的mRNA水平。(3)免疫印漬技術(shù)檢測層流切應(yīng)力刺激后ECs中AMP激活蛋白激酶(AMPK)水平及其磷酸化水平及PGC1α蛋白表達(dá)水平。(4)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)SIRT1表達(dá)后,觀察層流切應(yīng)力刺激后PGC1a、COX4及NRF1的mRNA水平的改變。(5)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制ECs內(nèi)CaMKKβ表達(dá)后,檢測Nrf2及SOD2的mRNA水平的改變。(7)分離野生型C57BL／6小鼠大腦中動(dòng)脈,連接至SoftEdge Acquisiton系統(tǒng),分別應(yīng)用CaMKKβ抑制劑STO-609和AMPK抑制劑Compound C或者二甲基亞砜(DMSO)預(yù)處理半小時(shí)后,檢測層流誘導(dǎo)的動(dòng)脈舒張情況。(7)分離CaMKKβ基因敲除小鼠、AMPKα2基因敲除小鼠及其野生對照組小鼠的大腦中動(dòng)脈,通過SoftEdge Acquisiton系統(tǒng)進(jìn)行離體血管內(nèi)灌注,檢測CaMKKβ或AMPKα2基因敲除時(shí)對層流誘導(dǎo)的血管舒張的影響。 結(jié)果：(1)層流切應(yīng)力增加線粒體生物合成：內(nèi)皮細(xì)胞線粒體體積增大。(2)層流切應(yīng)力能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)線粒體生物合成的主要基因表達(dá)PGC1a,NRF及COX4的表達(dá)。(3)層流切應(yīng)力通過SIRT1調(diào)節(jié)線粒體生物合成：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞內(nèi)SIRT1表達(dá)水平后,層流切應(yīng)力誘導(dǎo)的線粒體生物合成被顯著抑制,證明層流切應(yīng)力通過SIRT1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體生物合成。(4)層流切應(yīng)力能夠誘導(dǎo)AMPK活化,層流切應(yīng)力刺激后,ECs的AMPK磷酸化水平升高,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)CaMKKβ的表達(dá)后,AMPK磷酸化被抑制。(5)應(yīng)用CaMKKβ抑制劑STO-609和AMPK抑制劑Compound C預(yù)處理后,與DMSO對照組相比,層流誘導(dǎo)的大腦中動(dòng)脈舒張顯著被抑制(p0.05)。(6)與野生對照組相比,CaMKKβ基因敲除小鼠、AMPKα2基因敲除小鼠的大腦中動(dòng)脈被層流誘導(dǎo)的舒張程度顯著降低(p0.05)。 結(jié)論：層流切應(yīng)力能夠通過調(diào)節(jié)SIRT1增加細(xì)胞線粒體生物合成；層流切應(yīng)力通過CaMKKβ調(diào)節(jié)AMPK活化并誘導(dǎo)動(dòng)脈舒張功能。 研究意義：層流切應(yīng)力是公認(rèn)的血管系統(tǒng)保護(hù)性因素,生理?xiàng)l件下層流切應(yīng)力的存在對于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞正常功能,抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。
[Abstract]:AMP activated protein kinase ( AMPK ) is a serine / threonine protein kinase .



AMPK is considered to be one of the most promising target proteins in the future treatment of metabolic diseases and cardiovascular diseases , and AMPK is considered to be one of the most promising target proteins in the future treatment of metabolic diseases and cardiovascular diseases .



At present , because AMPK 偽 base and 尾 subunit cannot form protein crystals , the complete crystal structure of AMPK trimers is not completely clear . The protein structure stability is the basis of the biological activity of each biological enzyme .



Objective : To study the mechanism of AMPK interaction and its activity regulation .



Methods : ( 1 ) The expression level of AMPK - 偽 and 尾 - subunit protein was detected by means of protein - blot . ( 2 ) The expression of AMPK - 偽 and 尾 - subunit was detected by means of fluorescence real - time quantitative PCR .
Using GROMACS - 4.0 to show the change of atomic spatial locus of 尾 subunit in the presence or absence of 偽 subunit ;
( 6 ) Using AMPK 偽 subunit to knock out mouse fibroblast ( MEFs ) as AMPK enzyme activity detection system , the AMPK 偽 2 normal full length protein ( WT 偽 2 ) and mutein were transiently transfected , and the activity of AMPK kinase was detected by detecting the phosphorylation of acetyl CoA decarboxylase ( ACC ) downstream of AMPK .



Results : ( 1 ) The interaction of AMPK 偽 and 尾 subunit plays an important role in maintaining the protein stability of each other .



( 2 ) When 偽 subunit was absent , the mRNA level of 尾 1 and 尾 2 subunit was unchanged , protein stability decreased and protein degradation was accelerated . After 3 h treatment , the 偽 subunit knocked out the remaining 21 % of 尾 1 in the cells , while 尾 1 remained about 58 % in wild type cells ( p 0.05 ) .



( 3 ) The amino acids 412 ~ 426 on AMPK 偽 2 subunit of mouse have the key significance in the interaction of 偽 and 尾 . The deletion of amino acids 412 ~ 426 seriously affects the binding of 偽 2 subunit to 尾 subunit .



( 4 ) The deletion of amino acids ( 偽2鈻，

本文編號：2093962