本文選題：RNA干擾 + 小發(fā)夾RNA　； 參考：《浙江大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 背景: 大鼠SHARP-2蛋白是歸屬重要轉(zhuǎn)錄因子basic helix-loop-helix(bHLH)蛋白質(zhì)家族,在小鼠和人的相應(yīng)的蛋白質(zhì)為Stra13和Dec1。SHARP-2轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖,分化,腫瘤形成的起了重要的作用。我們的前期研究表明TGF-β可促進(jìn)SHARP-2的表達(dá),而SHARP-2轉(zhuǎn)錄因子又可促進(jìn)IL-2的分泌。以及在Stra13敲除小鼠中INF-γ和IL-2的表到下降,由此推測(cè)SHARP-2基因在器官移植中具有重要的作用。我們借助于RNA干擾技術(shù),通過靶向抑制SHARP-2的表達(dá),來研究SHARP-2在器官移植中的作用。RNA干擾主要是通過dsRNA被核酸酶切割成21-23 bp的siRNA雙鏈,進(jìn)而由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinduced silencing complex,Risc)分離并結(jié)合,后者在siRNA反義鏈的介導(dǎo)下識(shí)別并靶向切割同源性mRNA而阻止基因的翻譯過程。通過構(gòu)建shRNA表達(dá)載體,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shRNA,通過Dicer酶的作用下形成siRNA分子,達(dá)到對(duì)目的基因的沉默。目前腺病毒載體作為RNA干擾載體已有長(zhǎng)足的發(fā)展,并能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中達(dá)到目的基因的長(zhǎng)時(shí)程抑制。課題組獲得國(guó)家自然基金資助,本課題作為基礎(chǔ),構(gòu)建了特異性SHARP-2基因RNA干擾的腺病毒載體系統(tǒng),為SHARP-2基因在器官移植中的作用研究奠定基礎(chǔ)。 目的: 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄SHARP-2基因小發(fā)夾RNA(SHARP-2-shRNA)的腺病毒(Rad-hSHARP)。 方法: 一、設(shè)計(jì)能轉(zhuǎn)錄SHARP-2-shRNA模板的兩對(duì)DNA序列,退火后克隆至PDC316-EGFP-U6質(zhì)粒,構(gòu)建重組質(zhì)粒PDC316-SHARP-shRNA。 二、將PDC316-SHARP-shRNA與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdelEl3cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,進(jìn)行腺病毒載體(Rad-hSHARP)的構(gòu)建。 三、提取重組腺病毒的DNA,PCR鑒定正確者即為正確序列插入的重組腺病毒Rad-hSHARP。 四、在NRK細(xì)胞中對(duì)重組腺病毒干擾效果的鑒定。 結(jié)果: 一、測(cè)序鑒定表明PDC316-SHARP-shRNA構(gòu)建成功。 二、穿梭載體和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞成功構(gòu)建重組腺病毒顆粒,滴度較高。 三、PCR測(cè)序鑒定表明重組腺病毒(Rad-hSHARP)包含目的基因序列的插入。 四、RT-PCR表明重組腺病毒在NRK細(xì)胞中有干擾效果。 結(jié)論: 成功構(gòu)建轉(zhuǎn)錄SHARP-2基因小發(fā)夾RNA(SHARP-2-shRNA)的腺病毒(Rad-hSHARP),為利用特異性沉默SHARP-2基因在器官移植中的作用研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background: rat SHARP-2 protein belongs to an important transcription factor basic helix-loop-helix (bHLH) protein family. The corresponding proteins in mice and humans are Stra13 and Dec1. SHARP-2 transcription factors play an important role in cell proliferation differentiation and tumor formation. Our previous studies have shown that TGF- 尾 can promote the expression of SHARP-2, and SHARP-2 transcription factor can promote the secretion of IL-2. And the apparent decrease of INF- 緯 and IL-2 in Stra13 knockout mice, which suggested that SHARP-2 gene plays an important role in organ transplantation. We study the role of SHARP-2 in organ transplantation by targeting the inhibition of SHARP-2 expression by RNA interference. RNA interference is mainly mediated by dsRNA cleavage into 21-23 BP siRNA double strands by dsRNA. Then RNA-induced silencing complexRisc (RNA-induced silencing complexRisc) was isolated and conjugated, which was mediated by siRNA antisense chains to recognize and target homologous mRNAs to block gene translation. By constructing shRNA expression vector and expressing shRNAs in cells, siRNA molecules were formed by Dicer enzyme to silence the target gene. At present, adenovirus vectors as RNA interference vectors have been greatly developed, and can achieve long-term inhibition of the target gene in mammalian cells. The project was supported by the National Fund for Nature. Based on this project, the adenovirus vector system of specific SHARP-2 gene RNA interference was constructed, which laid a foundation for the study of the role of SHARP-2 gene in organ transplantation. Aim: to construct the adenovirus (Rad-hSHARP) of SHARP-2 gene small hairpin RNA (SHARP-2-shRNA). Methods: first, two pairs of DNA sequences were designed and cloned into PDC316-EGFP-U6 plasmid after annealing, and the recombinant plasmid PDC316-SHARP-shRNA was constructed. Secondly, PDC316-SHARP-shRNA and adenovirus skeleton plasmid pBHGloxdelEl3cre were co-transfected into 293 cells to construct the adenovirus vector (Rad-hSHARP). Thirdly, the recombinant adenovirus Rad-hSHARPwas identified by DNA polymerase chain reaction (DNA-PCR) of the recombinant adenovirus inserted with the correct sequence. 4. Identification of interference effect of recombinant adenovirus in NRK cells. Results: first, sequencing showed that PDC316-SHARP-shRNA was successfully constructed. Secondly, the recombinant adenovirus particles were successfully constructed by co-transfection of shuttle vector and skeleton plasmid into 293 cells, and the titer of recombinant adenovirus particles was higher. PCR sequencing showed that the recombinant adenovirus (Rad-hSHARP) contained the insertion of the target gene sequence. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) showed that the recombinant adenovirus had interference effect in NRK cells. Conclusion: the successful construction of the small hairpin RNA of SHARP-2 (SHARP-2-shRNA) adenovirus (Rad-hSHARP) lays a foundation for the study of the role of specific silencing of SHARP-2 gene in organ transplantation.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2072013