本文選題：產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌 + P60蛋白　； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的李氏桿菌病病原菌,引起腦膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)及敗血癥等。P60蛋白是LM保護(hù)性免疫的重要抗原,P60遭到破壞是導(dǎo)致LM滅活苗保護(hù)力較低的原因之一。 為增強(qiáng)LM滅活菌疫苗的免疫效力,本論文進(jìn)行了以下幾方面研究。 1產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌入侵相關(guān)蛋白P60基因的克隆、表達(dá)及純化。 用PCR擴(kuò)增LM 5782株iap基因,將其亞克隆至表達(dá)載體pET-30a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3),SDS-PAGE分析表明,表達(dá)的融合蛋白His-P60(簡(jiǎn)稱P60)分子量約為46 ku,主要在上清中表達(dá)。Western-blot表明,P60可被LM全菌多抗識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。利用His標(biāo)簽親和層析法純化His-P60至電泳純,分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度為3.5mg/mL。 2 P60對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌滅活苗免疫增強(qiáng)作用的研究 2.1 P60-LM滅活苗的免疫效力試驗(yàn) 將電泳純的P60(稀釋至1mg/mL)與LM滅活菌(1010個(gè)/mL)混合,加Montanide ISA206佐劑1:1混合制備疫苗(P60-LM),背部皮下免疫BALB/c小鼠0.2 mL。初免后21 d同法進(jìn)行二免,每隔7 d斷尾采血,用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)、MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群比例、用Goat anti-mice ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-4和IFN-γ的水平。二免21 d后,各組小鼠腹腔注射2×106 CFU/只(半數(shù)致死量)的LM活菌,48h后每組隨機(jī)抽取10只小鼠,檢測(cè)小鼠脾臟內(nèi)的平均活菌數(shù)及細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的繁殖率。各組剩余的10只小鼠,記錄2周內(nèi)小鼠死亡數(shù)及死亡時(shí)間。同時(shí),同法制備P60亞單位苗(P60蛋白1mg/mL)、LM滅活疫苗(1010個(gè)滅活菌/mL)及PBS空白對(duì)照組,此三個(gè)對(duì)照組以相同劑量相同程序進(jìn)行平行免疫,并對(duì)比檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。 結(jié)果表明,①一免后7 d開始,P60-LM滅活菌組的間接ELISA抗體效價(jià)均顯著高于三個(gè)對(duì)照組(P0.05),一免后14 d差異極顯著(P0.01);②二免后21 d, P60-LM滅活菌組(1.975±0.024)的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于LM滅活菌組(1.539±0.032)和PBS對(duì)照組(1.046±0.027)(P0.05),分別增加了26.11%和78. 45%,但與P60組(1.899±0.053)比較差異不顯著(P0.05);③T淋巴細(xì)胞亞群分析表明,P60-LM滅活菌組小鼠CD3+和CD4+細(xì)胞比例均高于其他各組,其中CD4+細(xì)胞分別比LM滅活菌組、P60組和PBS對(duì)照組增加了31.51%、26.37%和44.66%,而CD8+細(xì)胞平均降低了11.36%、9.72%和38.64%,CD4+/CD8+細(xì)胞平均比值分別增加了22.89%、60.46%和18.67%;④一免后第7 d開始,除PBS對(duì)照組以外,其它各組IL-4水平逐步降低, P60-LM組和P60組與其他兩組比較差異顯著(P0.05),除PBS對(duì)照組以外,其它各組IFN-γ水平差異不顯著(P0.05),但P60-LM組和P60組的IFN-γ/ IL-4比值升高,與其他各組比較差異顯著(P0.05);⑤攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明,攻毒后7 d,P60-LM組小鼠全部存活,三個(gè)對(duì)照組均有小鼠死亡;攻毒后14 d存活率為:P60-LM組為9/10、LM組4/10、P60組6/10、PBS組0;攻毒后48 h小鼠脾臟內(nèi)LM平均計(jì)數(shù)為:PBS組1.42×108CFU/ g,極顯著高于其它三組(P0.01),分別是P60-LM組、LM滅活菌組和P60組的194254.45、1392.16和118.33倍。2.2 P60-LLO-LM滅活苗對(duì)家兔的免疫效力試驗(yàn) 用家兔進(jìn)行P60-LLO-LM苗(P60蛋白1mg/mL+LLO蛋白0.3 mg/mL +1010個(gè)滅活菌/mL)、LM滅活菌和PBS空白苗的免疫試驗(yàn),通過對(duì)各組家兔的抗體水平、IL-4和IFN-γ的含量變化以及發(fā)病情況,體內(nèi)繁殖率的檢測(cè),證明P60和低劑量LLO能增強(qiáng)滅活疫苗的免疫保護(hù)效果,和BALB/c小鼠免疫試驗(yàn)的結(jié)果一致。 結(jié)論:添加P60可刺激小鼠T淋巴細(xì)胞向CD4+的Th型方向分化,并增加淋巴細(xì)胞刺激指數(shù),同時(shí)增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能;P60-LM苗和P60-LLO-LM苗的免疫保護(hù)力均顯著高于LM滅活苗和P60亞單位苗。
[Abstract]:浜у崟鏍哥粏鑳?yōu)鏉庢皬鏉嗚彛?

本文編號(hào)：2071949