本文選題：修飾型GM3 + 樹突狀細胞疫苗��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2010年碩士論文

【摘要】： 腫瘤相關糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)是腫瘤細胞表面表達最豐富的腫瘤相關抗原,是腫瘤免疫治療的重要靶標。GM3(monosialoganglioside 3)是N-乙�；僖核�-α(2-3)-吡喃型半乳糖-β-(1-4)吡喃型葡萄糖組成的三糖,以糖脂或糖蛋白形式大量表達在白血病等腫瘤細胞表面。由于天然TACAs或從天然TACAs制成的糖合物疫苗免疫原性低,為提高其免疫原性,前期我們用化學合成方法制備了N-苯乙�；僖核崛〈鶱-乙�；僖核岬男揎椥虶M3(GM3NPhAc)新抗原,與血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)耦聯制成了糖合物疫苗GM3NPhAc -KLH。研究表明,將含有非天然抗原結構的GM3NPhAc KLH免疫小鼠,能有效誘導產生針對新抗原的IgM,IgG1,IgG2a和IgG3多種類型的抗體。 鑒于機體抗腫瘤免疫機制中,細胞免疫比體液免疫發(fā)揮著更重要的作用,而GM3NPhAc-KLH主要誘導體液免疫,本研究將高免疫原性GM3NPhAc-KLH與樹突狀細胞(dendritic cell,DC)強大的抗原提呈功能相結合,制備DC疫苗,來誘導特異性抗腫瘤細胞免疫反應;同時根據細胞內糖鏈合成是一系列包括唾液酸轉移酶在內的酶促反應原理,應用糖生化工程(glycoengineering)的方法,利用N-苯乙�；事短前�(ManNPhAc)單糖前體促使腫瘤細胞表面合成修飾型的新糖鏈抗原GM3NPhAc,期望DC疫苗誘導特異性抗腫瘤細胞免疫反應清除腫瘤細胞,為腫瘤治療提供一種全新的高效、低毒的方法。本研究選擇白血病細胞為靶細胞,探討應用糖生化工程的方法促使白血病細胞表達修飾型GM3新抗原(GM3NPhAc)以及GM3NPhAc-KLH荷載樹突狀細胞制備的DC疫苗特異性抗白血病作用。 研究結果如下: 1.白血病細胞FBL3與ManNPhAc(0-2 mM)孵育24 h、48 h、72 h, ELISA結果顯示ManNPhAc(0.5-2 mM)處理48-72 h顯著促進FBL3細胞表面大量表達修飾型抗原GM3NPhAc;FBL3細胞與2 mM ManNPhAc共同孵育72 h后,免疫組化結果顯示FBL3細胞表面大量GM3NPhAc特異性染色;接種5×105 FBL3細胞7天的荷瘤小鼠連續(xù)7天腹腔注射ManNPhAc,1 mg/只,免疫組化結果顯示,腫瘤組織表面能表達大量的GM3NPhAc抗原,而不給予ManNPhAc的對照組小鼠腫瘤細胞則不表達GM3NPhAc抗原,表明糖生化工程的方法能促進白血病細胞表達修飾型GM3NPhAc新抗原; 2.抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)實驗結果顯示,腹腔巨噬細胞對GM3NPhAc特異性抗體介導的糖生化工程的FBL3細胞細胞毒作用顯著增加,FBL3細胞與0.05-0.35 mM GM3NPhAc孵育72 h,GM3NPhAc特異性抗體介導的巨噬細胞對其殺傷作用達到65%-80%;補體依賴的細胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)實驗結果顯示,補體對GM3NPhAc特異性抗體介導的的糖生化工程的FBL3細胞毒作用也顯著增加,FBL3細胞與0.15 mM ManNPhAC孵育72 h,補體對其殺傷作用達到100%。提示腫瘤細胞經很小量的修飾型單糖前體處理后,就能表達新的糖抗原,且可被新抗原的單克隆抗體所識別和機體免疫系統(tǒng)殺滅。 3.制備小鼠骨髓來源的DC,流式細胞儀鑒定結果表明DC的純度較高。培養(yǎng)五天的DC(2×10~6)加入20μg/ml GM3NPhAc-KLH培養(yǎng)過夜制備DC疫苗。 4.將制備的DC疫苗相隔7天免疫C57/Bl6小鼠2次,第二次免疫后一天取血檢測抗體,同時制備脾細胞用GM3NPhAc-KLH刺激制備細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)。小鼠血清抗體檢測表明,修飾型GM3NPhAc-KLH-DC組的Igκ,IgG明顯上升(P0.05),表現出疫苗活性。以表達修飾型GM3的FBL3細胞為靶細胞,以表達天然抗原的FBL3細胞為對照,LDH法觀察上述CTL對靶細胞的殺傷作用。結果表明,GM3NPhAc-KLH-DC誘導產生的CTL對經糖生化工程表達修飾型GM3的FBL3細胞的殺傷作用顯著高于KLH-DC組,同時也顯著高于對FBL3細胞的殺傷作用(P0.05),表明GM3NPhAc-KLH-DC是一個特異性的DC疫苗。 5. DC疫苗相隔7天免疫小鼠2次,d17皮下接種FBL3細胞(5×10~5),次日腹腔注射ManNPhAc溶液,1 mg/只,連續(xù)7天,觀察腫瘤的生長情況和存活率。結果顯示,GM3NPhAc-KLH-DC組小鼠的腫瘤體積小于DC和KLH-DC對照組,且生存期延長。表明GM3NPhAc-KLH-DC疫苗具有抗瘤活性。 結論:GM3NPhAc-KLH-DC疫苗能誘導特異性抗腫瘤免疫反應和抗瘤活性。DC疫苗結合糖生化工程的方法為高選擇性或靶向的腫瘤免疫治療提供一種全新的方法。
[Abstract]:鑲跨槫鐩稿叧緋栨姉鍘，

本文編號：2058818