本文選題：修飾型GM3 + 樹突狀細(xì)胞疫苗��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 腫瘤相關(guān)糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)是腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)最豐富的腫瘤相關(guān)抗原,是腫瘤免疫治療的重要靶標(biāo)。GM3(monosialoganglioside 3)是N-乙�；僖核�-α(2-3)-吡喃型半乳糖-β-(1-4)吡喃型葡萄糖組成的三糖,以糖脂或糖蛋白形式大量表達(dá)在白血病等腫瘤細(xì)胞表面。由于天然TACAs或從天然TACAs制成的糖合物疫苗免疫原性低,為提高其免疫原性,前期我們用化學(xué)合成方法制備了N-苯乙�；僖核崛〈鶱-乙�；僖核岬男揎椥虶M3(GM3NPhAc)新抗原,與血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)耦聯(lián)制成了糖合物疫苗GM3NPhAc -KLH。研究表明,將含有非天然抗原結(jié)構(gòu)的GM3NPhAc KLH免疫小鼠,能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生針對新抗原的IgM,IgG1,IgG2a和IgG3多種類型的抗體。 鑒于機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)制中,細(xì)胞免疫比體液免疫發(fā)揮著更重要的作用,而GM3NPhAc-KLH主要誘導(dǎo)體液免疫,本研究將高免疫原性GM3NPhAc-KLH與樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)強(qiáng)大的抗原提呈功能相結(jié)合,制備DC疫苗,來誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng);同時根據(jù)細(xì)胞內(nèi)糖鏈合成是一系列包括唾液酸轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的酶促反應(yīng)原理,應(yīng)用糖生化工程(glycoengineering)的方法,利用N-苯乙�；事短前�(ManNPhAc)單糖前體促使腫瘤細(xì)胞表面合成修飾型的新糖鏈抗原GM3NPhAc,期望DC疫苗誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)清除腫瘤細(xì)胞,為腫瘤治療提供一種全新的高效、低毒的方法。本研究選擇白血病細(xì)胞為靶細(xì)胞,探討應(yīng)用糖生化工程的方法促使白血病細(xì)胞表達(dá)修飾型GM3新抗原(GM3NPhAc)以及GM3NPhAc-KLH荷載樹突狀細(xì)胞制備的DC疫苗特異性抗白血病作用。 研究結(jié)果如下: 1.白血病細(xì)胞FBL3與ManNPhAc(0-2 mM)孵育24 h、48 h、72 h, ELISA結(jié)果顯示ManNPhAc(0.5-2 mM)處理48-72 h顯著促進(jìn)FBL3細(xì)胞表面大量表達(dá)修飾型抗原GM3NPhAc;FBL3細(xì)胞與2 mM ManNPhAc共同孵育72 h后,免疫組化結(jié)果顯示FBL3細(xì)胞表面大量GM3NPhAc特異性染色;接種5×105 FBL3細(xì)胞7天的荷瘤小鼠連續(xù)7天腹腔注射ManNPhAc,1 mg/只,免疫組化結(jié)果顯示,腫瘤組織表面能表達(dá)大量的GM3NPhAc抗原,而不給予ManNPhAc的對照組小鼠腫瘤細(xì)胞則不表達(dá)GM3NPhAc抗原,表明糖生化工程的方法能促進(jìn)白血病細(xì)胞表達(dá)修飾型GM3NPhAc新抗原; 2.抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)實驗結(jié)果顯示,腹腔巨噬細(xì)胞對GM3NPhAc特異性抗體介導(dǎo)的糖生化工程的FBL3細(xì)胞細(xì)胞毒作用顯著增加,FBL3細(xì)胞與0.05-0.35 mM GM3NPhAc孵育72 h,GM3NPhAc特異性抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對其殺傷作用達(dá)到65%-80%;補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)實驗結(jié)果顯示,補(bǔ)體對GM3NPhAc特異性抗體介導(dǎo)的的糖生化工程的FBL3細(xì)胞毒作用也顯著增加,FBL3細(xì)胞與0.15 mM ManNPhAC孵育72 h,補(bǔ)體對其殺傷作用達(dá)到100%。提示腫瘤細(xì)胞經(jīng)很小量的修飾型單糖前體處理后,就能表達(dá)新的糖抗原,且可被新抗原的單克隆抗體所識別和機(jī)體免疫系統(tǒng)殺滅。 3.制備小鼠骨髓來源的DC,流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果表明DC的純度較高。培養(yǎng)五天的DC(2×10~6)加入20μg/ml GM3NPhAc-KLH培養(yǎng)過夜制備DC疫苗。 4.將制備的DC疫苗相隔7天免疫C57/Bl6小鼠2次,第二次免疫后一天取血檢測抗體,同時制備脾細(xì)胞用GM3NPhAc-KLH刺激制備細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)。小鼠血清抗體檢測表明,修飾型GM3NPhAc-KLH-DC組的Igκ,IgG明顯上升(P0.05),表現(xiàn)出疫苗活性。以表達(dá)修飾型GM3的FBL3細(xì)胞為靶細(xì)胞,以表達(dá)天然抗原的FBL3細(xì)胞為對照,LDH法觀察上述CTL對靶細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明,GM3NPhAc-KLH-DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對經(jīng)糖生化工程表達(dá)修飾型GM3的FBL3細(xì)胞的殺傷作用顯著高于KLH-DC組,同時也顯著高于對FBL3細(xì)胞的殺傷作用(P0.05),表明GM3NPhAc-KLH-DC是一個特異性的DC疫苗。 5. DC疫苗相隔7天免疫小鼠2次,d17皮下接種FBL3細(xì)胞(5×10~5),次日腹腔注射ManNPhAc溶液,1 mg/只,連續(xù)7天,觀察腫瘤的生長情況和存活率。結(jié)果顯示,GM3NPhAc-KLH-DC組小鼠的腫瘤體積小于DC和KLH-DC對照組,且生存期延長。表明GM3NPhAc-KLH-DC疫苗具有抗瘤活性。 結(jié)論:GM3NPhAc-KLH-DC疫苗能誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)和抗瘤活性。DC疫苗結(jié)合糖生化工程的方法為高選擇性或靶向的腫瘤免疫治療提供一種全新的方法。
[Abstract]:鑲跨槫鐩稿叧緋栨姉鍘，

本文編號：2058818